高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法
【專利摘要】高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,涉及一種改性大豆分離蛋白的制備方法。所述制備方法步驟如下:將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液,控制溶液中蛋白與葡萄糖的質量比為0.5~4∶1,蛋白濃度為8%(w/v);將上述溶液密封后在70~90℃的條件下進行糖基化反應1~6h。本發明采用濕法糖基化改性來制備高溶解性和乳化性的改性大豆分離蛋白,容易操作,一步處理即可達到效果,節約成本和能源,為拓寬其在食品工業中的應用提供了理論依據。
【專利說明】高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種改性大豆分離蛋白的制備方法,具體涉及一種利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
【背景技術】
[0002]大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)是以低溫豆柏為原料分離提取的一種高純度植物蛋白質,由于其具有良好的功能性質和較高的營養價值,成為最重要的植物蛋白資源之一。但它常常由于缺乏良好的溶解性及乳化能力使其在某些食品中的應用受到限制,因此為了拓寬大豆分離蛋白的應用范圍,需要對其進行改性處理。
[0003]蛋白質糖基化改性是以美拉德反應為理論基礎的。美拉德反應,又稱“非酶褐變反應”,是蛋白質、多肽、氨基酸與還原糖之間的復雜反應。法國生物化學Louis CamileMaillard于1912年發現了該反應,美國化學家Hodge等人于1953年正式將該反應命名為“MaiIIard(美拉德)反應”,并提出了美拉德反應的網絡系統分類圖解,系統地闡述了反應機理。
[0004]美拉德反應可分為三個階段:
[0005](a)初級階段:還原糖(如葡萄糖)的羰基與具有自由氨基的化合物(如氨基酸、蛋白質中賴氨酸側鏈上的ε -氨基及末端氨基酸的α -氨基)之間進行加成反應生成N-糖基胺(Glycosilamine),經Amadori重排形成1-氨基_1_脫氧_2_酮糖。在Amadori產物形成之后,其降解取決于體系的PH值:pH ( 7,Amiadori產物在1,2位置上烯醇化產生糠醒或經甲基糠醒(Hydroxymethylfurfural HMF) ;pH≥7, Amiadori產物在2, 3位置上烯醇化產生還原酮類和一類裂解產物。產生的這些高活性的物質將參與后面階段的反應。
[0006](b)中級階段:主要發生Strecker降解。羰基和自由氨基發生縮合反應后,將氮引入終產物中。二羰基化合物繼續與氨基酸反應生成醛和α-氨基酮。
[0007](c)高級階段:成環、脫水、重排、異構等一系列反應均在進行;在最終反應階段,高級美拉德反應階段形成的眾多活性中間體,又可繼續與氨基酸反應,最終都生成類色素-褐色含氮色素,此過程包括醇醛縮合、醛氨聚合、環化合反應等。
[0008]目前用于蛋白質改性的方法很多,包括物理改性、化學改性和酶法改性等。糖基化改性是化學改性的一種類型,是蛋白質的ε -氨基酸與多羥基化合物之間發生美拉德反應,生成糖基化蛋白。由于該方法不需要外加化學試劑,是一個自然、自發的反應,因此成為一種理想的改性方法。國內外已有許多學者研究發現經糖基化改性后的蛋白質其溶解性和乳化能力均發生較大改變。Saeki等人在40°C條件下將魚肌原纖維蛋白與葡萄糖反應12h,它的溶解性得到顯著改善;蘇志光等人將大豆分離蛋白與甘露聚糖利用干法糖基化生成糖蛋白,經測定其溶解性顯著提高。Moreno等人將酪蛋白與乳糖在40°C下進行糖基化反應,其產物的乳化性得到明顯改善。趙海賢等人經研究表明在干熱條件下生成的大豆分離蛋白與葡聚糖共價結合物的乳化能力顯著提升。目前對大豆分離蛋白進行糖基化改性研究主要用干熱法制備多糖-復合物,耗時較長。
【發明內容】
[0009]針對現有大豆分離蛋白功能性比較低的問題,本發明提供一種利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法。
[0010]本發明提供的利用濕熱法糖基化改性大豆分離蛋白提高其溶解性和乳化性的方法,具體步驟如下:
[0011]將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液,溶液中大豆分離蛋白與葡萄糖的質量比為0.5?4: 1,大豆分離蛋白濃度為8% (w/v);將上述溶液密封后在70?90°C的條件下進行糖基化反應I?6h,將樣品冷凍干燥后置于4°C下保存備用。
[0012]研究證明:美拉德反應的程度和溫度、時間、系統中的組分及反應物濃度有關。濕熱法進行的接枝反應是指蛋白質與糖在溶液的條件下加熱進行,一般是單糖或雙糖,因此選擇葡萄糖這種價格低廉的單糖為反應底物。濕熱接枝反應是在一個密閉的裝置里放入蛋白質和糖的混合液,水浴或者油浴來控制反應的溫度從而調節反應的速度,在溫度< 90°C時反應速度較慢,溫度> 100°C時較快。當溫度> 100°C時,反應速度很快,反應不易控制,并且在工業生產中不易達到溫度要求,同時在高溫下容易形成蛋白與蛋白的聚合物,從而影響蛋白與糖的反應,因此選擇70?90°C。又由于在< 90°C條件下反應速度較慢,因此選擇反應時間為I?6h。不同配比的反應底物也會對糖基化反應速度和產物的功能性質產生一定的影響,因此選擇多個底物配比進行研究。之前研究表明,在高水分活度食品中,反應底物濃度被稀釋,不易發生美拉德反應,但在反應底物濃度較高時,又會由于溶液粘度過高而不易流動,從而影響反應的進行,因此選擇蛋白濃度為8%。
[0013]201210540762.5公開了 一種復合改性制備高效蛋白乳化劑的方法,該方法是利用物理改性(超聲波處理)與化學改性(糖基化改性)相結合的方式來制備高效蛋白乳化劑。而本發明中只單一用了濕法糖基化改性來制備高溶解性和乳化性的改性大豆分離蛋白,只經此一種化學改性同樣顯著改善了大豆分離蛋白的溶解性和乳化性。與201210540762.5相比,本發明優點在于容易操作,一步處理即可達到效果,節約成本和能源,并且超聲波處理由于其成本較高,一般在實驗室使用,目前工業上還較少使用。同時,本發明與201210540762.5在反應底物的濃度、配比及反應溫度和時間范圍均有不同。201210540762.5中使用緩沖溶液是要使反應在固定的pH值下進行,而本發明中是在自然條件下研究大豆分離蛋白糖基化改性對其溶解性和乳化性的影響,本發明使用去離子水同時也是為了排除離子對糖基化反應的影響。
[0014]本發明通過測定各糖基化產物的溶解度、乳化活性和乳化穩定性,研究糖基化溫度和時間、蛋白-葡萄糖質量比對大豆分離蛋白溶解性和乳化能力的影響。結果表明:蛋白與葡萄糖質量比為1: 2,反應溫度為80°C,反應時間為2h制得的糖基化大豆分離蛋白的溶解度最高,高達92.93%,是未改性SPI的4.38倍;蛋白與葡萄糖質量比為1: 1,反應溫度為90°C,反應時間為6h制得的糖基化大豆分離蛋白的乳化活性最高,高達0.63,是未改性SPI的3.94倍;蛋白與葡萄糖質量比為1: 2,反應溫度為90°C,反應時間為3h制得的糖基化大豆分離蛋白的乳化穩定性最高,高達50.92,是未改性SPI的1.98倍。糖基化改性可顯著提高大豆分離蛋白的溶解性和乳化性能,這為拓寬其在食品工業中的應用提供了理論依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(4: I)對大豆分離蛋白溶解性的影響;
[0016]圖2為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(2:1)對大豆分離蛋白溶解性的影響;
[0017]圖3為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: I)對大豆分離蛋白溶解性的影響;
[0018]圖4為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: 2)對大豆分離蛋白溶解性的影響;
[0019]圖5為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(4: I)對大豆分離蛋白乳化活性的影響;
[0020]圖6為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(2:1)對大豆分離蛋白乳化活性的影響;
[0021]圖7為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: I)對大豆分離蛋白乳化活性的影響;
[0022]圖8為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: 2)對大豆分離蛋白乳化活性的影響;
[0023]圖9為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(4: I)對大豆分離蛋白乳化穩定性的影響;
[0024]圖10為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(2:1)對大豆分離蛋白乳化穩定性的影響;
[0025]圖11為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: I)對大豆分離蛋白乳化穩定性的影響;
[0026]圖12為不同糖基化溫度和時間及蛋白-葡萄糖質量比(I: 2)對大豆分離蛋白乳化穩定性的影響。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明,但并不局限于此,凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的精神和范圍,均應涵蓋在本發明的保護范圍中。
[0028]本發明利用濕熱法制備葡萄糖-SPI復合物,通過測定產物的溶解度、乳化活性和乳化穩定性,研究糖基化溫度和時間、蛋白與葡萄糖質量比對大豆分離蛋白溶解性和乳化能力的影響,確定最佳工藝條件。
[0029]1、材料與方法
[0030]1.1材料與試劑
[0031]大豆分離蛋白(蛋白含量≥90% ):哈爾濱高科大豆食品公司;九三非轉基因大豆油:九三集團哈爾濱惠康食品有限公司;牛血清白蛋白:Sigma公司;SDS:Solarbio公司;葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國產分析純。
[0032]1.2儀器與設備
[0033]AL-104型精密電子天平:上海梅特勒_托利多儀器設備有限公司;DK_8B型電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實驗設備有限公司;冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司;QT-1旋渦混合器:上海琪特分析儀器有限公司;TGL-16C型高速離心機:上海安亭科學儀器廠;721型可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;T18高速勻漿機:德國IKA公司。
[0034]1.3試驗方法
[0035]1.3.1糖基化大豆分離蛋白的制備
[0036]將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液,溶液中蛋白與葡萄糖的質量比分別為4: 1、2: 1、1: 1、1: 2,其中蛋白濃度為8% (w/v) 0將上述溶液用保鮮膜密封放置在70°C、80°C和90°C的恒溫水浴鍋中進行糖基化反應,分別在反應開始的0、l、2、3、4、5、6h取出一定量的樣品,將樣品冷凍干燥后置于4°C下保存備用。雙縮脲法測定樣品中蛋白質含量。
[0037]1.3.2糖基化大豆分離蛋白溶解性的測定
[0038]參照孫煥等人的雙縮脲法,并稍作修改。將制備得到的樣品配制成蛋白濃度1%(w/v)的溶液,充分攪拌后,3000r/min離心30min,取上清液ImL于試管中,加入雙縮脲試劑4mL,振蕩后放置30min,于540nm處進行比色測定,根據標準曲線計算出上清液中蛋白含量。
[0039]1.3.3糖基化大豆分離蛋白乳化能力的測定
[0040]參照Tang等人的濁度法,并稍作修改。將樣品溶于0.2mol/L (pH7.0)的磷酸鹽緩沖溶液中,使蛋白濃度為lmg/mL,將2mL大豆油和8mL樣品溶液放入直徑為2.5cm的塑料離心管中高速勻漿lmin,分別于O和IOmin從離心管底部吸取50 μ L勻漿液加入到5mL0.1 %SDS溶液中,振蕩混勻后在500nm處測定吸光值,記作Atl和A1(l。用0.1 % SDS溶液作為空白對照。用零時刻的吸光值Atl表示乳化活性(emulsifying activity, EA),乳化穩定性(emulsifying stability, ES)用如下公式表示:
[0041]
【權利要求】
1.高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,其特征在于所述制備方法步驟如下:將一定量的大豆分離蛋白和葡萄糖用蒸餾水配制成混合均勻的溶液,控制溶液中大豆分離蛋白與葡萄糖的質量比為0.5?4: I ;將上述溶液密封后在70?90°C的條件下進行糖基化反應I?6h。
2.根據權利要求1所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,其特征在于所述大豆分離蛋白濃度為8% (w/v) 0
3.根據權利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質量比為1: 2,反應溫度為80°C,反應時間為2h。
4.根據權利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質量比為1: 1,反應溫度為90°C,反應時間為6h。
5.根據權利要求1或2所述的高乳化性和高溶解性的改性大豆分離蛋白的制備方法,其特征在于所述大豆分離蛋白與葡萄糖質量比為1: 2,反應溫度為90°C,反應時間為3h。
【文檔編號】A23J3/16GK103652316SQ201310697737
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】夏秀芳, 孔保華, 呂鴻鵠, 韓建春, 鄭環宇, 李芳菲 申請人:東北農業大學