利用蔗渣纖維素發酵生產l-乳酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，以蔗渣為原料，通過原料預處理、纖維素酶解，以霉菌為發酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細胞發酵或固定化細胞發酵生產L-乳酸。該法原料易得、成本低廉；酶解得到的還原糖量與其他報道相比較高，發酵周期短，發酵液分離容易，產品轉化率高；既可采用游離發酵，也可進行固定化發酵，后者固定細胞可重復利用，產酸率穩定，乳酸轉化率高。總之，本發明是一種適應于工業化的高效轉化蔗渣纖維素生產L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生產成本，解決了乳酸菌發酵過程難控制以及游離細胞對分離提純造成的難度問題，具有良好的工業應用前景。
【專利說明】利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵生產有機酸的【技術領域】，尤其涉及一種利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法。
【背景技術】
[0002]L-乳酸(L-lactic acid)是在微生物發酵過程中通過L-乳酸脫氫酶的催化作用將丙酮酸轉換成的左旋乳酸。與D-乳酸相比，由于L -乳酸可被人體直接吸收，且無任何副作用，所以被廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域。
[0003]目前發酵產L-乳酸的微生物主要是乳酸菌和根霉菌，乳酸菌對營養成分要求高，而且是兼性厭氧型微生物，發酵過程中不好控制，生產的L-乳酸光學純度也不高。傳統發酵多采用游離細胞發酵方式，游離發酵中，真菌菌絲比較發達，經常出現凝塊和結團現象，懸浮的菌絲體還會增加發酵液的粘度，減少了細胞間的氧氣傳遞，降低了乳酸的產量，而且對后續的分離過程也有影響，分離難度大，得到的產物少。
[0004]生產成本是制約L-乳酸應用的關鍵因素之一。工業化生產都采用淀粉質原料，這大大增加了生產成本。而一些廉價可再生的原料，如生物質原料，含有豐富的碳水化合物，可用于L-乳酸的生產。我國是農業大國，每年產生上億噸的農林廢棄物，但是只有極少數被有效地利用，大部分被作為廢棄物丟掉。這不僅浪費了豐富的可再生資源，而且也污染了環境。因此，若能利用這些生物質纖維素來生產L-乳酸等各類高附加值產品，走“變廢為寶”的路線，應用前景 將非常廣闊。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種生產成本低、發酵周期短、工藝簡單可控、產品純度高的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，以蔗渣為原料，通過原料預處理、纖維素酶解，以霉菌為發酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細胞發酵或固定化細胞發酵生產L-乳酸。
[0007]原料預處理按以下操作進行:用粉碎機粉碎蔗渣，過20-40目篩；精確稱取過篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質量濃度為0.6-0.8%的H2O2和3_5%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌3-5h ;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘渣于105°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機粉碎，過20-40目篩，收集備用。
[0008]纖維素酶解按以下操作進行:精確稱取預處理后的蔗渣，按每g蔗渣加入濃度為10mg/mL的纖維素酶液4_8mL，底物濃度28_66g/L，pH4.0-5.4的檸檬酸緩沖溶液17_21mL，于45-55°C、轉速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36_60h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用，測定酶解液中的還原糖含量。
[0009]上述利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，采用游離細胞發酵方式，按以下操作進行:[0010]〈1>斜面培養:將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養4-6天，后于4°C冰箱中保存；
[0011]〈2>孢子懸浮液:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過濾，用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ；
[0012]<3>種子培養:將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為20_70mL的三角瓶中，于28-32°C、200r/min下培養12_24h，制成種子培養液；
[0013]<4>發酵培養:將種子培養液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，發酵36_72h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液；發酵結束后，對發酵液進行抽濾，取清液，按EDTA法測定L-乳酸的濃度，計算L-乳酸的轉化率(L-乳酸的轉化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%)。
[0014]斜面培養基按以下配制:馬鈴薯200g，加水1000mL,葡萄糖15_25g，瓊脂15_25g，加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min ；
[0015]種子培養基按以下配制:葡萄糖為50_70g/L，酵母膏(氮源)5_7g/L，KH2PO40.3-0.5g/L, MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.08g/L, CaC0310g/L, 121。。滅菌20min, CaCO3分開滅菌。
[0016]發酵培養基按以下配制:酶解液30-38g/L，(NH4) 2S043_7g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.04-0.08g/L, CaC0310_30g/L，121。。滅菌 20min, CaCO3分開滅菌。
[0017]上述利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，采用固定化細胞發酵方式，按以下操作進行:
[0018]〈1>斜面培養:將菌種米根`霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養4-6天，后于4°C冰箱中保存；
[0019]<2>孢子懸浮液:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過濾，用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ；
[0020]<3>ACA微膠囊法固定化細胞制備:將滅菌的質量濃度為1.5-2.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液(按5:1)—起混合于滅過菌的三角瓶中充分搖勻；用同一型號的注射器(內徑Imm)將混合液逐滴加入到質量濃度2.0-3.0%的CaCl2溶液中，鈣化0.5-1.5h，形成直徑為3-4mm的海藻酸鈣微球，去掉上清液,用無菌水洗去CaCl2,再于質量濃度0.4-0.8%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內液化15_25min，濾去處理液，用無菌水洗凈，用無菌生理鹽水于4°C下保存(不超過3天)，備用。
[0021]<4>固定化細胞培養:將固定化細胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養12_24h，制成固定化細胞培養液；
[0022]<5>發酵培養:將固定化細胞培養液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，發酵36_50h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液；發酵結束后，對發酵液進行抽濾，取清液，按EDTA法測定L-乳酸的濃度，計算L-乳酸的轉化率(L-乳酸的轉化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%。[0023]固定化發酵時間為36h。
[0024]固定化細胞的重復利用批次為7批。
[0025]針對目前L-乳酸生產存在的問題，發明人以蔗渣為原料，首次建立了利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，通過原料預處理、纖維素酶解，以霉菌為發酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細胞發酵或固定化細胞發酵生產L-乳酸。該法原料易得、成本低廉；酶解得到的還原糖量與其他報道相比較高，發酵周期短，發酵液分離容易，產品轉化率高；既可采用游離發酵，也可進行固定化發酵，后者固定細胞可重復利用，產酸率穩定。總之，本發明是一種適應于工業化的高效轉化蔗渣纖維素生產L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生產成本，解決了乳酸菌發酵過程難控制以及游離細胞對分離提純造成的難度問題，具有良好的工業應用前景。
【具體實施方式】
[0026]實施例1蔗渣纖維素的酶解
[0027]用粉碎機粉碎蔗渣，過20目篩；精確稱取過篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質量濃度為0.7%的H2O2和4%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌4h ;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘渣于105°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機粉碎，過40目篩，收集備用。
[0028]精確稱取預處理后的蔗渣lg，加入濃度為10mg/mL的纖維素酶液7mL，底物濃度40g/L，pH5.0的檸檬酸緩沖溶液18mL，于50°C、轉速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用。
[0029]利用DNS法測定酶解液中的還原糖的濃度，結果顯示，測得酶解液中還原糖濃度為 34.36g/L。
[0030]實施例2游離細胞發酵
[0031]<1>斜面培養基的配制:將馬鈴薯去皮，稱取200g，加水1000mL,煮沸30min，過濾，濾去馬鈴薯塊，將濾液補至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂20g,加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min，傾斜擺放，冷卻即得；
[0032]〈2>菌種的斜面培養:將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養5天，后于4°C冰箱中保存；
[0033]<3>孢子懸浮液的制備:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過濾，用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ；
[0034]<4>按以下配方“葡萄糖為60g/L,酵母膏(氮源)7g/L, KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.3g/L, ZnSO4.7H200.08g/L, CaC0310g/L” 配成 50mL 的種子培養基，121°C滅菌20min, CaCO3分開滅菌。
[0035]<5>種子培養:將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養18h，制成種子培養液；
[0036]〈6> 發酵培養基按以下配制:酶解液 36.49g/L，(NH4) 2S045g/L，KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.2g/L, ZnSO4.7H200.04g/L, CaC0320g/L, 121°C滅菌 20min，CaCO3 分開滅菌。
[0037]<7>游離細胞發酵:將種子培養液按10%的接種量接入到發酵培養基裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、200r/min下， 發酵72h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液。[0038]發酵結束后，對發酵液進行抽濾，取清液，按EDTA法測定L-乳酸的濃度，計算L-乳酸的轉化率(L-乳酸的轉化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%)，測得的乳酸的轉化率為28.45%。
[0039]實施例3固定化細胞發酵
[0040]<1>斜面培養基的配制:將馬鈴薯去皮，稱取200g，加水1000mL,煮沸30min，過濾，濾去馬鈴薯塊，將濾液補至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂15g,加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min，傾斜擺放，冷卻即得；
[0041]〈2>菌種的斜面培養:將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養5天，后于4°C冰箱中保存；
[0042]<3>孢子懸浮液的制備:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過濾，用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ；
[0043]<4>ACA微膠囊法固定化細胞制備:將滅菌的質量濃度為1.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液(按5:1)—起混合于滅過菌的三角瓶中充分搖勻；用同一型號的注射器(內徑Imm)將混合液逐滴加入到質量濃度2.5%的CaCl2溶液中，鈣化lh，形成直徑為3_4_的海藻酸鈣微球，去掉上清液，用無菌水洗去CaCl2,再于質量濃度0.6%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內液化15min，濾去處理液，用無菌水洗凈，用無菌生理鹽水于4°C下保存(不超過3天)，備用。
[0044]<5>按以下配方“葡萄糖為50g/L,酵母膏(氮源)7g/L, KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.4g/L, ZnSO4.7H200.08g/L, CaC0310g/L” 配成 50mL 的種子培養基，121°C滅菌20min, CaCO3分開滅菌。`
[0045]<5>固定化細胞培養:將固定化細胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養24h，制成固定化細胞培養液；
[0046]〈6> 發酵培養基按以下配制:酶解液 36.49g/L，(NH4) 2S045g/L，KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.3g/L, ZnSO4.7H200.06g/L, CaC0320g/L, 121°C滅菌 20min，CaCO3 分開滅菌。
[0047]<7>固定化細胞發酵培養:將固定化細胞培養液按14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、200r/min下，發酵36h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液。
[0048]發酵結束后，對發酵液進行抽濾，取清液，按EDTA法測定L-乳酸的濃度，計算L-乳酸的轉化率(L-乳酸的轉化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%，結果測得乳酸的轉化率為31%。
[0049]<8>固定化細胞的重復利用發酵:待第一批發酵結束后，在無菌條件下，用紗布過濾發酵液，用無菌生理鹽水洗凈固定化小球，接入到新鮮的培養基，于30°C，200r/min下發酵36h，發酵結束，重復上面的操作，用EDTA法測定每批發酵液中乳酸的濃度，結果發現，重復利用的批次為7批，之后乳酸轉化率呈下降的趨勢。
【權利要求】
1.一種利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于以蔗渣為原料，通過原料預處理、纖維素酶解，以霉菌為發酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細胞發酵或固定化細胞發酵生產L-乳酸。
2.根據權利要求1所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于原料預處理按以下操作進行:用粉碎機粉碎蔗渣，過20-40目篩；精確稱取過篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質量濃度為0.6-0.8%的H2O2和3-5%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌3-5h;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘渣于105°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機粉碎，過20-40目篩，收集備用。
3.根據權利要求2所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于纖維素酶解按以下操作進行:精確稱取預處理后的蔗渣，按每g蔗渣加入濃度為lOmg/mL的纖維素酶液4-8mL，底物濃度28-66g/L，pH4.0-5.4的檸檬酸緩沖溶液17_21mL，于45_55°C、轉速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36_60h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用。
4.根據權利要求3所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于采用游離細胞發酵方式，按以下操作進行: 〈1>斜面培養:將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養4-6天，后于4°C冰箱中保存； <2>孢子懸浮液:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散,用滅菌的脫脂棉過濾,用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ； <3>種子培養:將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為20-70mL的三角瓶中，于28-320C >200r/min下培養12_24h，制成種子培養液； <4>發酵培養:將種子培養液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，300C、180-200r/min下，發酵36_72h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液。
5.根據權利要求4所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于: 所述斜面培養基按以下配制:馬鈴薯200g，加水lOOOmL，葡萄糖15_25g，瓊脂15_25g，加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min ； 所述種子培養基按以下配制:葡萄糖為50-70g/L，酵母膏5-7g/L，KH2PO40.3-0.5g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.08g/L, CaC0310g/L, 121。。滅菌 20min, CaCO3 分開滅菌； 所述發酵培養基按以下配制:酶解液30-38g/L，(NH4) 2S043-7g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.04-0.08g/L, CaC0310_30g/L，121。。滅菌 20min, CaCO3分開滅菌。
6.根據權利要求3所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于采用固定化細胞發酵方式，按以下操作進行: 〈1>斜面培養:將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養基中，于28°C培養4-6天，后于4°C冰箱中保存； <2>孢子懸浮液:取一支已培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無菌的玻璃珠充分打散,用滅菌的脫脂棉過濾,用無菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個孢子/mL ；<3>ACA微膠囊法固定化細胞制備:將滅菌的質量濃度為1.5-2.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液按5:1 —起混合于滅過菌的三角瓶中充分搖勻；用內徑1_同一型號的注射器將混合液逐滴加入到質量濃度2.0-3.0%的CaCl2溶液中，鈣化0.5-1.5h，形成直徑為3-4mm的海藻酸鈣微球，去掉上清液，用無菌水洗去CaCl2,再于質量濃度0.4-0.8%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內液化15_25min，濾去處理液，用無菌水洗凈，用無菌生理鹽水于4°C下保存，備用； <4>固定化細胞培養:將固定化細胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養12-24h，制成固定化細胞培養液； <5>發酵培養:將固定化細胞培養液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，300C、180-200r/min下，發酵36_50h，得到含發酵產物L-乳酸的發酵液。
7.根據權利要求6所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于:所述固定化發酵時間為36h。
8.根據權利要求7所述的利用蔗渣纖維素發酵生產L-乳酸的方法，其特征在于:固定化細胞的重復利用批次為7批。`
【文檔編號】C12P7/56GK103627739SQ201310691303
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】孫衛東, 唐艷瓊, 戴莉, 唐湘毅, 蘇芬芬 申請人:廣西大學