一種漆酶基因Lac7及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法

一種漆酶基因Lac7及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種漆酶基因Lac7及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用，該漆酶基因Lac7的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明通過13種染料對重組雞腿菇漆酶脫色進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)重組漆酶Lac7+10AA的脫色作用主要發(fā)生在反應(yīng)開始的1，2小時內(nèi)，隨著時間的延長，脫色速度減緩，純酶的脫色效果明顯優(yōu)于粗酶液，且無論粗酶還是純酶在加入HBT后脫色率都會增加。Lac7+10AA對雷瑪唑亮藍(lán)和孔雀石綠的脫色效果比較好，加入介體HBT后脫色率都可達(dá)90%以上。具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。
【專利說明】一種漆酶基因Lac7及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種漆酶基因Lac7及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍(lán)蛋白同源，都屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族，由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，其在紡織染料脫色和紙漿漂白，高分子合成，環(huán)境檢測，食品工業(yè)，解毒和生物修復(fù)等方面具有潛在應(yīng)用價值，因此，關(guān)于漆酶的異源表達(dá)及其表達(dá)調(diào)控的研究成為目前國際上酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的熱點。
[0003]關(guān)于食用真菌漆酶的研究越來越多，例如已經(jīng)出現(xiàn)蜜環(huán)菌、杏鮑菇、雞腿菇、平菇、香菇、金針菇等的相關(guān)報道。現(xiàn)在關(guān)于漆酶的研究不僅涉及其生物學(xué)特性、分離純化等方面，而且已經(jīng)深入到分子水平進(jìn)入基因工程階段。但多種漆酶自身的表達(dá)量很低，對漆酶基因的克隆和序列分析，使其在異源宿主上高效表達(dá)重組漆酶蛋白，是解決其高表達(dá)并得以應(yīng)用是一個重要的手段，因此一直有人研究漆酶的異源表達(dá)。
[0004]漆酶具有多種同功酶，不同來源的真菌漆酶，在分子量、對溫度和pH的適應(yīng)性以及耐受能力、酶反應(yīng)動力學(xué)等特征方面都有一定的差異，同一生物產(chǎn)生的不同同功酶的酶學(xué)特性也存在差異。因此還需要對漆酶進(jìn)行不斷的深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種漆酶基因Lac7。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述漆酶基因Lac7的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供一種上述漆酶基因Lac7的應(yīng)用。通過對13種不同染料的脫色作用，為漆酶的外源表達(dá)及其工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。
[0006]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種漆酶基因Lac7，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述漆酶基因的表達(dá)蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不。
[0009]一種所述漆酶基因的表達(dá)蛋白的表達(dá)方法，在所述的SEQ ID N0.2所不氣基酸序列上添加有10個氨基酸序列組成的表達(dá)標(biāo)簽，所述的氨基酸序列為TPFPPFNTNS ;所表達(dá)的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述的漆酶基因Lac7在對染料的脫色中的應(yīng)用。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的漆酶基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用，具有的優(yōu)點在于:通過13種染料對重組雞腿菇漆酶脫色進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)重組漆酶Lac7+10AA的脫色作用主要發(fā)生在反應(yīng)開始的1，2小時內(nèi)，隨著時間的延長，脫色速度減緩，純酶的脫色效果明顯優(yōu)于粗酶液，且無論粗酶還是純酶 在加入HBT后脫色率都會增加。Lac7+10AA對雷瑪唑亮藍(lán)和孔雀石綠的脫色效果比較好，加入介體HBT后脫色率都可達(dá)90%以上。具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是雞腿菇總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M為Marker，I為提取的雞腿菇總RNA ；
[0013]圖2是雞腿菇DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M為Marker，1、2為提取的雞腿菇DNA ；
[0014]圖3是簡并性引物的擴增結(jié)果圖；左圖為一號位與二號位引物PCR結(jié)果，右圖為一號位與四號位引物PCR結(jié)果；
[0015]圖4是重組質(zhì)粒PCR篩選鑒定結(jié)果圖；圖中，M為Marker，1-8為陽性克隆結(jié)果；
[0016]圖5是重組質(zhì)粒PCR篩選鑒定結(jié)果圖；圖中，M為Marker，1-10為陽性克隆結(jié)果；
[0017]圖6是5’ RACE擴增結(jié)果圖；M為Marker, I號泳道為擴增產(chǎn)物；D:lac75’ RACE ；
[0018]圖7是漆酶3’ -RACE擴增結(jié)果；
[0019]圖8是Iac7+10AA Xba I，sac II酶切位點的PCR獲得電泳圖，M為Marker, I號為PCR引入酶切位點的結(jié)果；
[0020]圖9是重組質(zhì)粒Iac7+10AA PCR篩選鑒定結(jié)果圖，M為Marker ;1_10號泳道為挑選的白斑做PCR的結(jié)果；
[0021]圖10是重組質(zhì) 粒提取結(jié)果電泳圖；M:mark, 3:lac7+10AA ；
[0022]圖11是麗平板生物反應(yīng)檢測漆酶lac7活性結(jié)果圖；B:lac7+10AA ；
[0023]圖12是重組漆酶的生長曲線圖；
[0024]圖13是銅離子濃度對漆酶Iac7+10AA表達(dá)的影響結(jié)果圖；
[0025]圖14是酶液經(jīng)分離純化后SDS-PAGE檢測結(jié)果圖；
[0026]圖15是雞腿菇重組漆酶Lac7+10AA的最適溫度結(jié)果圖；
[0027]圖16重組漆酶Lac7+10AA的熱穩(wěn)定性結(jié)果圖；
[0028]圖17重組漆酶Lac7+10AA的最適反應(yīng)pH結(jié)果圖；
[0029]圖18重組漆酶Lac7+10AA的pH穩(wěn)定性結(jié)果圖；
[0030]圖19是不同時間對Lac7+10AA純酶(無介質(zhì))脫色的影響結(jié)果圖；
[0031]圖20是不同時間對Lac7+10AA純酶(有介質(zhì))脫色的影響影響結(jié)果圖；
[0032]圖21是重組雞腿菇漆酶Lac7+10AA對蒽醌類染料的脫色結(jié)果圖；
[0033]圖22是重組雞腿菇漆酶Lac7+10AA對偶氮類染料的脫色結(jié)果圖；
[0034]圖23是重組雞腿菇漆酶Lac7+10AA對三苯甲烷類染料的脫色結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0036]實施例1
[0037](I)雞腿菇菌絲的獲取
[0038]將雞腿菇菌種從試管斜面接種到PDA平板上，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用滅過菌的直徑為Icm的打孔器在長滿菌絲的PDA平板上(雞腿菇需十天左右)打孔，挑四塊菌落放于每個滅過菌的250mL三角瓶中(每瓶含有30mL液體培養(yǎng)基)，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第10天，加入咖啡酸(終濃度為ImM)誘導(dǎo)，第22天收集菌絲。將菌絲用紗布過濾，然后用PBS沖洗兩次,液氮速凍后放入_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0039](2)總RNA的提取
[0040]采用Invitrogen的TRIZOL試劑提取，具體過程:將雞腿菇樣品從_80°C冰箱中取出，液氮研磨成粉末；取適量粉末加入ImL TRIZOL試劑，振蕩6次，每次15s，室溫放置5min ;加入0.2mL氯仿,震蕩混合均勻，室溫靜置5min ;用小于等于12000g的轉(zhuǎn)速4°C離心15min ;上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管,加入異丙醇0.25mL, NaAc0.25mL上下顛倒數(shù)次室溫靜置IOmin,用不超過12000g的轉(zhuǎn)速離心4°C離心IOmin ;棄上清,沉淀用75%乙醇清洗,用槍輕柔吹打，使沉淀漂起；用小于7500g的速度4°C離心5min ;棄上清，加入75%乙醇再次漂洗，離心步驟同上；棄上清干燥RNA，加入20-30 μ LDEPC-H2O溶解，_80°C保存。
[0041]提取的RNA跑瓊脂糖電泳，經(jīng)電泳分離和溴化乙錠染色后，根據(jù)高豐度的28S和18S核糖體RNA (rRNA)條帶的亮度來判斷RNA的完整性。粗提取的RNA經(jīng)非變性1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，樣品出現(xiàn)18S和28S兩條RNA特征亮帶，RNA質(zhì)量較好，可以后續(xù)使用。
[0042](3)雞腿菇基因組DNA的提取
[0043]真菌DNA的提取方法參照實驗手冊:取Ig菌絲，用液氮研磨充分；加入IOmL DNAlysis buffer (0.1M Tris-Hcl (pH8.0),0.05M EDTA，0.5%SDS，1%β -巰基乙醇，65°C保溫Ih ;加入等體積苯酹:氯仿:異戍醇(25:24:1), 1000Og,4°C, 15min ;轉(zhuǎn)上清至一干凈離心管，加等體積氯仿:異戊醇(24:1)，10000g，4°C，15min ;轉(zhuǎn)上清液，加入1/3體積的3M NaAc(ρΗ5.2)，一倍體積異丙醇;-20°C放置I小時，10000g，4°C，5min ;加入15mL75%乙醇，漂洗DNA沉淀，室溫放置干燥30min (至無乙醇味)；加入500 μ L TE buffer溶解，轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管；加入RNasel0uL，37°C保溫Ih ;酚仿抽提:①加入I倍體積酚,室溫放置lOmin，13000rmp, IOmin,取上清·?，② 1/2 體積酹+1/2 體積氯仿，室溫放置 lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清?、垡槐扼w積氯仿，室溫放置lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清。乙醇沉淀:①2倍體積無水乙醇，1/10 體積 3M NaAc (ρΗ5.2)，_20°C放置數(shù)小時；? 4°C，16000rmp，離心 15min，棄上清；③加入75%乙醇漂洗沉淀2次，風(fēng)干；④加入500 μ L TE buffer溶解沉淀，-20°C保存。
[0044]提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2所示，可見在5000bp以上有清晰條帶，此DNA可用作后續(xù)試驗。
[0045](4)雞腿菇漆酶基因組DNA序列的獲得
[0046]多數(shù)真菌漆酶是單體蛋白質(zhì)，酶分子中一般都含有4個銅原子，根據(jù)銅結(jié)合區(qū)的保守氨基酸序列可設(shè)計簡并性引物，克隆漆酶。
[0047]擴增漆酶基因片段引物:一號位正向引物:5’ -CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3 ’ ；二號位反向引物:5’-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3’ ；四號位反向引物:5’ -TGCCARTCDATRTGRCARTG-3’。
[0048]普通PCR，采用 25 μ L PCR 體系:2yL25XdNTP Mix, 1.5μ L Mg+ (MgCl2),
2.5μ L10XAdvantage2PCR buffer, 15.375 μ L PCR-H2O, 2.5 μ L 模板 DNA，0.125 μ L RTaq,
0.5μ L正向引物，0.5μ L反向引物。
[0049]PCR 條件:95°C (lmin),95°C (30s)，55°C (30s)，72°C (2min) ;28circles。
[0050]目的片段的回收，步驟如下:(I)先稱量空的1.5mL的離心管的質(zhì)量，隨后稱量放入膠的離心管的重量。以便測得膠的重量，Img對應(yīng)I μ L。(2)加入buffer GC于68°C恒溫水浴中6~Smin至完全溶解(期間每過2分鐘最好搖晃數(shù)次以確保充分溶解)。(3)將溶解后的溶液轉(zhuǎn)入純化專用離心管中，12000g，lmin。(4)棄管中溶液，加入500MLDNA WashingBuffer, 12000g, lmin。(5)棄管中溶液，空轉(zhuǎn)一次以去除DNA Washing Buffer中殘留的酒精。(6)取一干凈的離心管，將過濾器置于離心管中。(7)加入約30yL ddH20充分溶解，12000g，離心lmin。(8)為保證目的樣完全溶解，將試管中的溶解液吸出并再次打入過濾器，再次離心。(9)取5 μ L提純后的DNA，進(jìn)行鑒定DNA質(zhì)量。
[0051]使用一號位正向引物和二號位反向引物、一號位正向引物和四號位反向引物，以提取的DNA為模板，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示，一號位與二號位引物的擴增產(chǎn)物大小在200bp左右，一號位與四號位引物的擴增產(chǎn)物大小在1600bp左右，這與預(yù)期結(jié)果相同，可用這些擴增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)試驗。
[0052]純化產(chǎn)物與PCR載體的連接:純化產(chǎn)物加A (腺嘌呤)尾后放入PCR儀中，70°C，30min。加尾體系為:I μ LlOXPCR buffer (Mg2+free)、I μ L MgCl2 (25mM)U μ L dATP(50X )>1 μ L Taq polymerase、7 μ L 純化產(chǎn)物。
[0053]將上述加完A尾的片段連接到PCR載體上，4°C連接過夜。連接體系為:I μ LlOXligation buffer,2y L PCR2.lvector、6 μ L 加 A 尾后的產(chǎn)物、I μ L T4DNAIigase0
[0054]制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞:活化大腸桿菌，用IL的三角瓶(加250mLLB培養(yǎng)基)培養(yǎng)菌，約2小時,測OD值在0.5即可。分裝5OmL離心管中離心，2000g,離心6mim。加IOmL氯化1丐(先在冰中放置)懸浮，3管并I管,最后定容至20mL。1200g,6min離心。加IOmL氯化鈣輕輕懸浮，在冰中放置30min。1200g,6min離心。加2mL~3mL氯化鈣懸浮,分裝IOOul一管，一80°C保存。
[0055]轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞:①將DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(200 μ I)從_80°C冰箱中取出，冰上解凍。②將連接產(chǎn)物加入化凍的DH5a中，用移液槍混合均勻。③冰浴30min甚至更長時間。④42°C熱擊2min `(精確)。⑤加入0.5mL LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm，搖床培養(yǎng)I小時。⑥由于菌液較濃，故不進(jìn)行離心濃縮，IPTG40y L和X_Gal20l.! L混合均勻，后將菌體加入涂LBA平板。⑦37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0056]藍(lán)白斑及菌落PCR篩選陽性克隆并測序:從涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板中挑取白斑為模板，以T7、M13reverse為引物用程序2.2.4.2進(jìn)行PCR擴增，篩選長度合適的白斑，取陽性菌株測序。把兩組PCR產(chǎn)物與PCR載體相連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，37°C過夜培養(yǎng)得到藍(lán)白斑，根據(jù)β -葡糖糖苷酶的α -互補原理，知道得到的白斑是插入外源基因片段的陽性克隆。對白斑進(jìn)行菌落PCR篩選，以確定插入外源基因片段的重組質(zhì)粒。
[0057]由于M13reverse，T7引物間長度大約180bp，所以擴增出來的片段比插入片段要大，結(jié)果如圖4和5所示,重組轉(zhuǎn)化效率很高，隨機各挑取若干測序。以通用M13reverse,T7為引物PCR篩選出擴增出片段長度合適的菌體，測序。獲得雞腿菇基因組DNA序列片段。
[0058]引物設(shè)計是RACE能否成功的重要因素。根據(jù)已測序獲得的雞腿菇基因組DNA序列片段設(shè)計了用于擴增雞腿菇5’端序列的基因特異性引物:
[0059]Laccase7GSPl:5’ -CTCCGGAACCACCATCAGCCCAATTAG-3，；[0060]5’ RACE 反應(yīng)體系:2.5μ L5，RACE-ready cDNA、5y L UPM (10X )、1 μ L LaccaseGSPl >41.5 μ L Master Mix (34.5 μ L PCR_H20、I μ L50 X Advantage2polymerase Mix、5μ L10XAdvantage2PCR bufferU μ L50XdNTP Mix)。
[0061]PCR 程序:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s,65°C 30s, 72°C 3min ；34cycles ；72°C 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0062]使用CLONTECH 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification 試劑盒，以總 RNA 為原料合成的5’ -RACE ready cDNA為模版(方法同3’ -RACE ready cDNA)，用試劑盒自帶引物UPM和漆酶特異性引物L(fēng)accase7GSPl擴增，電泳檢測結(jié)果如圖6所示，漆酶基因5’ -RACE擴增后在500bp左右位置都出現(xiàn)一條特異性亮帶，擴增效果明顯，擴增產(chǎn)物使用TIANGEN的Universal DNA Purification Kit 純化后-20°C保存。
[0063]目的片段的回收純化、純化產(chǎn)物與PCR載體的連接、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白斑篩選陽性克隆、測序，方法均同上。
[0064]漆酶5’ -RACE擴增、純化后的片段與PCR2.1Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，根據(jù)β-葡糖糖苷酶的α -互補原理，得到的白斑很有可能是插入外源基因片段的陽性克隆。因此每組隨機挑取10個白色菌落進(jìn)行菌落PCR擴增，而后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇條帶位置正確的送公司測序。獲得5’ -RACE序列片段序列如下:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種漆酶基因Lac7，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述漆酶基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.—種權(quán)利要求2所述漆酶基因的表達(dá)蛋白的表達(dá)方法，其特征在于:在所述的SEQID N0.2所示氨基酸序列上添加有10個氨基酸序列組成的表達(dá)標(biāo)簽，所述的氨基酸序列為TPFPPFNTNS ;所表達(dá)的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
4.權(quán)利要求1所述的漆酶 基因Lac7在對染料脫色中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK103710364SQ201310690989
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】丁少軍, 顧春娟, 王燕 申請人:南京林業(yè)大學(xué)