一種定量谷類生物殘留dna的標準操作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于谷類作物的重組蛋白質中殘留DNA的定量方法，其特征在于,包括以重組蛋白質產品中殘留DNA為模板，以SYBR?Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。
【專利說明】一種定量谷類生物殘留DNA的標準操作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種定量谷類生物殘留DNA的標準操作方法。
【背景技術】
[0002]近年來，分子農業用于生產重組藥用蛋白質得到快速發展[1]。從可擴展性、安全性和成本效益方面而言，植物為重組藥物蛋白的生產提供了具有前途的平臺，可能是傳統的如細菌，酵母，哺乳動物細胞培養等發酵系統以外的另一替代性生產平臺。谷類作物的種子，如水稻、大麥和玉米，都可能有希望成為理想的寄主[2]。最近，水稻種子已成功地表達了多種重組蛋白，如人類α-抗胰蛋白酶，T細胞表位肽，霍亂毒素B亞基(CTB)，雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)免疫原VP2，并大規模生產了人血清白蛋白[3_7]。其中一些蛋白質已進入臨床研究階段[8’9]。
[0003]作為臨床用途，生物藥物的生產必須牢記的是產自細胞基質的產品所含寄主殘留DNA水平應當盡可能低。目前的監管指引建議，最終產品中寄主殘留DNA的劑量應少每劑lOOpg，對某些寄主而言是每劑10ng[1°’n]。因此，嚴格控制藥用級別的重組蛋白質藥物中的殘留DNA含量是非常重要的，因為它直接關系到人類的安全。定量藥物中殘留DNA的傳統方法包括PicoGreen法,雜交檢測法,閾值技術(threshold technology)和qPCR[n4]。這些檢測方法中，由于其靈敏度，準確度，精密度和省時等特點，qPCR分析方法被認為是最實用的殘留DNA定量方法。其已成功地開發并用于定量大腸桿菌、NSO (小鼠骨髓瘤細胞)和CHO (中國倉鼠卵巢細胞)細胞的殘留DNA。
[0004]然而，至今仍沒有關于植物類寄主殘留DNA的定量分析方法。隨著使用植物細胞，如稻米[3_9]，作為寄主的分子農業的迅速發展，開發一種靈敏的分析方法來定量稻米源性藥物的殘留DNA非常有必要。在qPCR分析方法中，已知在較短的時間內，目標DNA序列的初始拷貝數量與達到閾值信號是成比例的。因此，為了達到這個目的，盡可能選擇基因組中拷貝數多的內參DNA序列是有利的。通常用于殘留DNA分析的多拷貝元件有如LINE-1LINE-2, BI, B2和LTRtl5]。同時，由于核糖體DNA的多拷貝數和高度保守，也經常被用于評估殘留DNA基因來進行殘留DNA分析[16]。盡管還有其他的現有技術[17]，大部分研究人員還是依賴于TaqMan探針或SYBR綠色染料進行qPCR分析。本發明致力于開發一種定量分子農業產品，如水稻重組人血清白蛋白(OsrHSA)的殘留DNA的qPCR分析方法。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種用于重組蛋白質中殘留DNA的定量方法，包括以重組蛋白質產品中殘留DNA為模板，以SYBR Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。進一步地，所述重組蛋白質是谷類作物的重組蛋白質。
[0006]進一步地，所述qPCR反應包括使用以下引物:
[0007]正向引物5 ’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3 ’ ；[0008]反向引物5 ’ -CGGGTGTCATTTCTTAAAATAG-3 ’。
[0009]所述TaqMan探針的序列為:
[0010]FAM-5，-TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3，-BHQl。
[0011]所述正向引物的濃度為4-10 μ M，反向引物的濃度為4-10 μ M ;其中所述正向引物的濃度優選為10 μ Μ，反向引物的濃度優選為4 μ Μ。
[0012]更進一步地，本發明所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反應過程為:
[0013]95 0C，10 分鐘，I 個循環；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 個循環；93-96°C 15-25 秒，55-60。。20-30 秒，I 個循環，以 0.7V /s 上升熔化。
[0014]優選地，所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反應過程為:
[0015]95°C, 10 分鐘，I 個循環；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個循環；95°C 15-25秒，60°C 20-30秒，I個循環，以0.7°C /s上升熔化。
[0016]本發明所述使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應過程為:
[0017]50-530C 1.5-2.5 分鐘，I 個循環；93-96°C 15-25 秒，55-60°C 25-35 秒，30-40 個循環。
[0018]優選地,所述使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應過程為:
[0019]50。。1.5-2.5 分鐘，I 個循環；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個循環。
[0020]本發明還提供了所述qPCR方法優選的反應體系，包括:
[0021]
【權利要求】
1.一種用于重組蛋白質中殘留DNA的定量方法，其特征在于，包括以重組蛋白質產品中殘留DNA為模板，以SYBR Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。
2.如權利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重組蛋白質是谷類作物的重組蛋白質。
3.如權利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR反應包括使用以下引物: 正向引物 5’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3’ ； 反向引物 5’ -CGGGTGTCAITTCTTAAAATAG-3’。
4.如權利要求1或2所述的定量方法，其中所述TaqMan探針的序列為:
FAM-5’ -TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3’ -BHQl。
5.如權利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的濃度為4-10μ M，反向引物的濃度為4-10 μ Μ。
6.如權利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的濃度為ΙΟμΜ，反向引物的濃度為4 μ Μ。
7.如權利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反應過程為: 95 °C,10 分鐘，I 個循環；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 個循環；93-96 °C 15-25 秒，55-60 °C 20-30 秒，I 個循環，以 0.7。。/s 上升熔化。
8.如權利要求7所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反應過程為: 95°C, 10 分鐘，I 個循環；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個循環；95°C 15-25 秒，60 0C 20-30秒，I個循環，以0.7°C /s上升熔化。
9.如權利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應過程為: 50-530C 1.5-2.5 分鐘，I 個循環；93~96V 15-25 秒，55-60。。25-35 秒，30-40 個循環。
10.如權利要求9所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應過程為: 50V 1.5-2.5 分鐘，I 個循環；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個循環。
11.如權利要求3所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反應體系包括:
12.如權利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反應體系包括:
13.如權利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述谷類作物為選自水稻、小麥和大麥。
14.如權利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重組蛋白質為重組人血清白蛋白。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757099SQ201310686660
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】楊代常, 陳鎮 申請人:武漢大學