一種利用提油后藻渣生產生物乙醇的方法
【專利摘要】一種利用提油后藻渣生產生物乙醇的方法，將藻渣制成藻漿，加入纖維素酶，混合均勻，調節pH6.0，置于45~60℃水浴中3~6小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入硝酸鈉或氯化銨、硫酸鎂和磷酸二氫鈉；121℃，20分鐘滅菌后，接入酵母菌發酵，溫度30~40℃、初始pH5.0~7.0、100~500轉/分鐘攪拌，發酵48~72小時；以變速流加方式流加滅菌后的酶解液，收集乙醇氣體。本發明發酵過程操作簡單，生產成本低，乙醇產率高，無環境污染，可規模化，實現廢棄物資源化，是一種滿足工業化需求、實用性很強的新方法。
【專利說明】—種利用提油后藻渣生產生物乙醇的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]眾所周知，能源、環境和糧食問題系人類社會面臨和必須解決的三大難題。微藻生物能源是目前國際上公認緩解上述危機的理想途徑之一，發展潛力巨大。微藻種類繁多、分布廣，是一群最簡單、最古老的低等植物，微藻能夠利用陽光、CO2及廢水中的N、P等營養物快速生長并可在胞內合成大量油脂等代謝物。利用微藻細胞可制備出生物柴油等多種形式的生物能源產品，目前微藻生物能源已經成為國內外研究熱點領域之一。針對微藻生物能源，美國于2007年啟動了“微型曼哈頓計劃”，其宗旨是向海洋藻類要能源，以幫助美國擺脫嚴重依賴進口石油的窘境；2008年，英國碳基金公司啟動了利用藻類開發航空燃料項目，投入2600萬英鎊用于發展相關技術和基礎設施，該項目預計到2020年實現商業化；我國科技部于2011年啟動了首個微藻能源“973計劃”項目，旨在強化我國在微藻生物能源方面的基礎研究。通過世界各國共同的努力，微藻生物能源研究已經取得了巨大的進展，但距離產業化尚有一段路程要走。這主要是由于當前微藻油脂產率低、后加工能耗高、提油后藻渣未被利用等造成生產成本過高。
[0003]微藻細胞除含油脂外，還含大量的碳水化合物，蛋白質等，因此在微藻制備高品質生物柴油過程中會產生大量的殘余物質，即提油后藻渣，以上物質若不加以利用將造成藻體殘渣高價值多元組成的浪費和環境污染。實際上，藻體殘渣是重要的生物質資源。經相關轉化技術，將提油后藻渣轉化 成糖類物質和蛋白質，通過產乙醇酵母發酵，可獲得純凈的生物乙醇。目前微藻生產生物柴油尚未實現工業化生產，目前采用的生產方式微藻產油效率比較低，還沒有發現一種可將提油后藻渣充分利用的方法。本專利即為一種利用提油后藻渣酶解液發酵產乙醇的方法，充分利用微藻生物質資源，提高微藻生物柴油生產系統整體經濟性，該工藝路線尚未有文獻報道。
【發明內容】
[0004]針對現有技術中提油后藻渣未被充分利用，木質纖維素類生物質(水稻秸桿等)轉化生物乙醇預處理成本高、副產物多等問題，本發明的目的在于提供一種利用提油后藻渣酶解后發酵生產生物乙醇的方法，該方法高效、藻渣酶解效率高、發酵生產生物乙醇生產成本低、酶解液利用效率高、藻渣較木質纖維素類生物質更容易酶解、反應條件溫和、環境友好、操作過程簡單。
[0005]本發明的目的可以通過以下技術方案實現的。
[0006]一種利用提油后藻渣生產生物乙醇的方法，其特征在于藻渣經酶解，滅菌后發酵產乙醇，發酵過程流加酶解液。具體步驟為。
[0007](I)藻渣加入水，制成藻漿，按藻渣干物質5-50mg/g的量加入纖維素酶，混合均勻，調節pH6.0，置于45飛(TC水浴中3飛小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液。
[0008](2)水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸鈉或氯化銨、20(Tl000mg/L硫酸鎂和20(T500mg/L磷酸二氫鈉；121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、攪拌轉速100~500轉/分鐘，發酵時間48~72小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為f 5mL/L/h，最后6小時流加速度為f 5mL/L/h，中間階段流加速度為l(T20mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體。
[0009]利用高效液相色譜儀檢測藻渣酶解液中糖含量，用凱氏定氮儀測定藻渣酶解液中蛋白質含量，用氣相色譜儀檢測生物乙醇產量。
[0010]本發明所述酵母菌為釀酒酵母cereFisiae),可從中國工業微生物菌種保藏管理中心獲得，其保藏編號為CICC 1747。
[0011]本發明所述的纖維素酶為購自酶制劑公司丹尼斯克子公司杰能科國際有限公司的市售商品酶 Accellerase 1000 或 Excel 纖維素酶或 Accellerase 1500 或 AccelleraseTRIO或Accellerase DUET或購自諾維信公司的市售商品酶Celluclast 1.5L或Novozyme188 或 Novozyme 476 或 Novozyme988 或 Cellic CTec2。
[0012]本發明生物乙醇的生產是利用提油后藻渣，酵母發酵產乙醇過程變速流加藻渣酶解液，利用易于酶解的生物質藻渣產乙醇，提高乙醇產率，發酵過程操作簡單，生產成本低，無環境污染，可規模化，實現廢棄物資源化 ，是一種滿足工業化需求、實用性很強的新方法。
【具體實施方式】
[0013]本發明將通過以下實施例作進一步說明。
[0014]以下實施例所用到的小球藻，可從中國典型微生物保藏中心(武漢)獲得，其保藏編號為CCTCC M209256 ;所用到的微擬球藻、原核小球藻和雨生紅球藻，可從美國德州大學UTEX藻種庫獲得，其保藏編號分別為LB2164、256和2505;所用到的萊茵衣藻，可從中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫獲得，其保藏編號為FACHB-265。
[0015]實施例1。
[0016]將小球藻藻種經無菌操作接種于滅菌培養基(mg/L):NaCl 24000, Na2EDTA 10，FeSO4.7Η20 50,NaH2PO4 20,MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培養箱中靜置培養，培養溫度250C，光照強度2000Lux，培養10天。培養到第10天的500g小球藻經離心(8000轉/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經高壓滅菌鍋預處理(121°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經離心(12000轉/分鐘，15分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來水或蒸餾水，制成藻衆，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質)，混合均勻，調節pH6.0，置于55°C水浴中4小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測其中糖含量和蛋白質含量。
[0017]水與藻渣酶解液之比為9:1，并加入200mg/L硝酸鈉、200mg/L硫酸鎂和500mg/L磷酸二氫鈉，121°C,20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度37°C、初始pH
5.5、攪拌轉速200轉/分鐘，發酵時間72小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為3mL/L/h，最后6小時流加速度為3mL/L/h，中間階段流加速度為15mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體。結果見表1。
[0018]實施例2。
[0019]將微擬球藻藻種經無菌操作接種于滅菌培養基(mg/L):NaCl 30000, Na2EDTA 20，FeSO4.7Η20 30,NaH2PO4 30,MgCl2 20和NaNO3 200置于光照培養箱中靜置培養，培養溫度250C，光照強度2000Lux，培養10天。培養到第10天的500g微擬球藻經離心(8000轉/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗3次，經高壓滅菌鍋預處理(121°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經離心(15000轉/分鐘，10分鐘)后，用蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(40mg/g藻渣干物質)，混合均勻，調節pH6.0,置于60°C水浴中3小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測其中糖含量和蛋白質含量。
[0020]水與藻渣酶解液之比為7:1，并加入300mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和400mg/L磷酸二氫鈉，115°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度35°C、初始pH6.0、攪拌轉速200轉/分鐘,發酵時間60小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為5mL/L/h，最后6小時流加速度為5mL/L/h，中間階段流加速度為15mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體。結果見表1。
[0021]實施例3。
[0022]將原核小球藻藻種經無菌操作接種于滅菌培養基(mg/L):蛋白胨1000, NaCl 25,CaCl2.2H20 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養箱中靜置培養，培養溫度25°C，光照強度2000LUX，培養10天。培養到第10天的500g原核小球藻經離心(8000轉/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經高壓滅菌鍋預處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的藻漿體積比為I:1:2，水相經離心(12000轉/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質)，混合均勻，調節pH6.0，置于50°C水浴中5小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測其中糖含量和蛋白質含量。
[0023]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度40°C、初始pH6.5、攪拌轉速300轉/分鐘,發酵時間60小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為lmL/L/h，最后6小時流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體。結果見表1。
[0024]實施例4。
[0025]將雨生紅球藻藻種經無菌操作接種于滅菌培養基(mg/L):NaCl 25, Na2EDTA 50,FeSO4.7H20 4.98，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75，ZnSO4.7H20 8.82，CaCl2.2H2025，CuSO4.5Η20 1.57，MnCl2 1.44，MoO3 0.71, H3BO3 11.42，KOH 31 和 NaNO3 250 置于光照培養箱中靜置培養，培養溫度25°C，光照強度2000LUX，培養10天。培養到第10天的500g雨生紅球藻經離心(8000轉/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經高壓滅菌鍋預處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經離心(12000轉/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質)，混合均勻，調節PH6.0,置于50°C水浴中5小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測其中糖含量和蛋白質含量。
[0026]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、硫酸鎂300mg/L和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度40°C、初始pH
.6.5、攪拌轉速300轉/分鐘,發酵時間60小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為lmL/L/h，最后6小時流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體用于檢測。結果見表1。
[0027]實施例5。
[0028]將萊茵衣藻藻種經無菌操作接種于滅菌培養基(mg/L):NaCl 25，Na2EDTA 0.05，FeCl3.6Η20 0.5, K2HPO4 75, KH2PO4 175，MgSO4.7Η20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養箱中靜置培養，培養溫度25°C，光照強度2000Lux，培養10天。培養到第10天的500g萊茵衣藻經離心(8000轉/分鐘，10分鐘)獲得濕藻體，蒸餾水沖洗5次，經高壓滅菌鍋預處理(115°C，20分鐘)后，用正己烷和乙醇來提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的藻漿體積比為1:1:2,水相經離心(12000轉/分鐘，20分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12h后得到藻渣，藻渣加入自來水或蒸餾水，制成藻漿，加入纖維素酶(20mg/g藻渣干物質)，混合均勻，調節PH6.0，置于50°C水浴中5小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液；檢測其中糖含量和蛋白質含量。
[0029]水與藻渣酶解液之比為4:1，并加入400mg/L硝酸鈉、300mg/L硫酸鎂和300mg/L磷酸二氫鈉，121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度40°C、初始pH
.6.5、攪拌轉速300轉/分鐘,發酵時間60小時。發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為lmL/L/h，最后6小時流加速度為lmL/L/h，中間階段流加速度為20mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體用于檢測。結果見表1。
[0030]對比例I。
[0031]將釀酒酵母經無菌操作接種于滅菌發酵液(mg/L):葡萄糖60 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麥芽汁2 000，置于發酵罐中發酵，發酵溫度37°C，初始pH 5.5、攪拌轉速150轉/分鐘，發酵72小時。分析乙醇產量，結果見表1。
[0032]對比例2。
[0033]將釀酒酵母經無菌操作接種于滅菌發酵液(mg/L):葡萄糖50 000，蛋白胨5000，酵母粉2 000，麥芽汁2 000，置于發酵罐中發酵，發酵溫度37°C，初始pH 5.5、攪拌轉速300轉/分鐘，發酵60小時。分析乙醇產量，結果見表1。
[0034]表1實施例及對比結果
【權利要求】
1.一種利用提油后藻渣生產生物乙醇的方法，其特征是按以下步驟: (1)在藻渣加入水，制成藻漿，按藻渣干物質5-50mg/g的量加入纖維素酶，混合均勻，調節pH6.0,置于45飛(TC水浴中3飛小時，酶解過程加攪拌，反應結束后經離心得到上清液即為藻渣酶解液； (2)水與藻渣酶解液之比為9~3:1，并加入10(Tl000mg/L硝酸鈉或氯化銨、20(Tl000mg/L硫酸鎂和20(T500mg/L磷酸二氫鈉；121°C，20分鐘滅菌后，接入酵母菌進行發酵，發酵過程中溫度3(T40°C、初始pH 5.0-7.0、攪拌轉速100~500轉/分鐘，發酵時間48~72小時；發酵過程中補料以流加方式進行，流加滅菌后的酶解液，流加采用變速流加，起始6小時流加速度為f5mL/L/h，最后6小時流加速度為f 5mL/L/h，中間階段流加速度為l(T20mL/L/h，流加速度通過設置發酵罐相關參數來控制；收集乙醇氣體。
【文檔編號】C12P7/10GK103710394SQ201310685311
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】劉玉環, 鄭洪立, 阮榕生, 高振, 萬益琴, 黃和, 巫小丹, 王允圃 申請人:南昌大學