一種耐高溫堿性木聚糖酶的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐高溫堿性木聚糖酶，屬于酶制劑制備【技術領域】。以產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701為出發菌株經液體深層發酵制備。本發明的耐高溫堿性木聚糖酶酶比活力為350-420IU/ml；適用溫度范圍為40-75℃，最適反應溫度65℃，在75℃酶活完全穩定；適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為10.0。比現有的耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高，耐溫度高，耐堿性強，酶作用最適pH值范圍寬泛，特別適合造紙、食品和飼料等領域的工業化需求。
【專利說明】一種耐高溫堿性木聚糖酶
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶制劑制備【技術領域】，特別是一種耐高溫堿性木聚糖酶。
【背景技術】
[0002]纖維素、半纖維素和木質素是植物半纖維素的主要成分，它們共同作用構成了植物細胞壁的支撐骨架，在三者之中半纖維素占據了植物干重的35%以上，半纖維素也是多種復合聚糖的總稱，其主要成分為木聚糖，它是一種復雜的多聚五碳糖。木聚糖的主鏈是通過β -1-4糖苷鍵把多個吡喃木糖基連接起來，側鏈上連接著不同的取代基，這樣有乙酰基、葡萄糖醛酰基、L-阿拉伯糖基等(Collins et al.，2005)。所以木聚糖的完全降解就需要多種酶的共同參與。一般將木聚糖分為硬木木聚糖和軟木木聚糖。硬木木聚糖主要是由
O-乙酰-4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成，以β -1-4糖苷鍵相連。軟木聚糖由阿拉伯
4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖殘基聚合而成(Beg et al，2001)。有的分類方法也把木聚糖分為可溶性木聚糖和不可溶性木聚糖。
[0003]木聚糖酶(1，4-β _D_xylanase:EC3.2.1.8)是一種重要的工業用酶,在分解木聚糖時起生物催化作用，可以將木聚糖分解成多糖或單糖的蛋白質或RNA。木聚糖酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內等都能產生木聚糖酶。
[0004]由于木聚糖酶在工業上潛在的應用價值，在近十年內引起了人們的更多注意，其中堿性木聚糖酶主要應用于紙漿和造紙企業。堿性木聚糖酶在造紙行業中的應用主要包括制漿、協助漂白、改纖維性質、廢紙脫墨等方面。
[0005]在工業生產中，制漿·過程是在堿性的條件下，用高溫蒸煮的方法除去木質素，為使溶解制漿纖維素純度達到98%，這就需要大量的氫氧化鈉處理紙漿，造成了嚴重的環境污染，為此許多學者轉而嘗試生物處理制漿，而用于制漿漂白的木聚糖酶應是耐熱和耐堿的。馮建良等(Kimura et al.2000)用木聚糖酶預處理麥草與常規化學法制漿進行了比較試驗，木聚糖酶預處理提高了原料的脫木素程度，還可以降低制漿的卡伯值。木聚糖酶在輔助漂白方面有較廣泛而深入的研究，且取得了很大成果。研究發現，無論是針葉木漿、闊葉木漿或是竹漿、草漿，木聚糖酶均可以降解紙漿中殘余的木質素，提高了白度(AL BALAA etal, 2006 ；Meek and Lipman, 1922)。用于紙衆漂白的木聚糖酶必須具有耐高溫特點,Khasin等得到了一個來源于堿性菌株Bacillus sterarothermophiIus T26木聚糖酶,該木聚糖酶在pH9.0及65°C時對紙漿有最好的漂白效果(Khasin et al，1993)，很多木聚糖酶不具備這樣的特點，限制了商業化應用。全世界每年產生的廢紙數量是驚人的，廢紙回收后再利用工作就變得尤為重要了，可以使在資源重復利用的同時也保護了環境。1991年，由韓國學者首次報道了應用木聚糖酶能將油墨從新聞廢紙漿中脫除。此后，人們開始研究利用木聚糖酶進行廢紙脫墨，以減輕或消除化學脫墨帶來的環境污染(曹軍衛等，2004)。
[0006]目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經成為世界各國造紙業紙漿漂白發展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美洲的30余家大型紙廠得到應用，成為生物技術在造紙工業應用最成功的一例。其中加拿大有約10%的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于制漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產品，但到目前為止，工業上應用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應溫度大多在50°C左右，眾所周知，紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強堿的條件下進行的，使得現有的低溫酸性木聚糖酶產品在此領域的應用受到極大的限制，另外，在飼料和食品領域，木聚糖酶應用在飼料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高溫條件下能夠保持較高的酶活，因此，研究開發耐高溫的木聚糖酶產品將會帶來良好的經濟效益和社會效益。
[0007]從天然微生物中篩選性質更為優良的木聚糖酶產酶菌，是一個有效獲得高產木聚糖酶菌株的一個最有效的手段。自從木聚糖酶具有生物漂白功能以來，人們把更多的目光投向了堿性木聚糖酶，篩選了很多具有應用前景的堿性木聚糖酶的生產菌株，分離了很多堿性木聚糖酶。1973年，Horikoshi等首次發現了來自堿性細菌中的木聚糖酶(Horikoshiand Atsukawa, 1973),從堿性細菌Bacillus sp.N0.C25922中純化得到木聚糖酶,它的最適PH為6-8。之后，發現了來自堿性細菌Bacillus N0.C2125的2個木聚糖酶:木聚糖酶A及木聚糖酶N，其中木聚糖酶A在pH12時也有一定的酶活(Honda et al，1985)。Dey等(Deyet al，1992)分離的嗜堿嗜熱菌Bacillus sp.(NCM59)，能產生2個沒有纖維素酶活性的木聚糖酶，它們具有很好的耐堿性，最適pH為10.0。Nakamura等報道了來源于堿性菌株Bacillus sp.41M21的胞外木聚糖酶J它的最適pH為9.0 (Nakamura et al,1993)。大多數真菌產生的木聚糖酶一般為酸性木聚糖酶，但也有例外，Taneja等篩選到一株嗜堿真菌AspergillusnidulansKK299,它產的木聚糖酶的最適 pH 為 8(Taneja et al, 2002),并且該酶對硬木木聚糖比軟木木聚糖有更高的親和性。
[0008]中國專利CN101701205A公開了一種耐堿性木聚糖酶XynE2及其基因和應用，所產耐堿性木聚糖酶最適PH值7.8，最適溫度65°C ;中國專利CN102586134B公開了一株生產耐堿耐鹽木聚糖酶的海洋綠色產色鏈霉菌菌株及其應用，所產木聚糖酶最適pH值6.0，最適溫度70°C ;中國專利CN102321558A公開了一種耐高溫木聚糖酶的高產菌種及利用該菌發酵產耐高溫木聚糖酶的方法及得到的 酶，所產耐高溫木聚糖酶最適PH值7.0，最適溫度60。。。
[0009]由此看來，國際及國內諸多專家、學者及科研工作人員不惜資金、人力和時間，加大了對耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發力度，旨在將生物技術在造紙、食品、飼料等領域的應用推向一個更高、更新、更強的新時代，無論是新菌種的獲得，還是采用基因重組技術，雖然耗費了如此之大的財力及精力，但結果不盡人意，很難達到耐高溫、耐堿性木聚糖酶的研發目標及要求，要么耐溫不耐堿；要么耐堿不耐溫；要么耐堿耐高溫范圍不寬泛；要么木聚糖酶不純并有纖維素酶活性；要么作用底物不適等等，制備一種耐堿性更強、耐溫度更高、耐堿耐高溫范圍寬泛、不具有纖維素酶活性且適合造紙、食品和飼料等領域的耐高溫堿性木聚糖酶仍是本領域技術人員不懈的追求和研發方向。
【發明內容】
[0010]本發明所解決的技術問題是克服現有耐高溫堿性木聚糖酶的產品缺陷，以產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)701為出發菌株,并通過優化培養基組成和發酵工藝制備出一種耐高溫、耐堿性強、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性的適合造紙、食品和飼料等領域的耐高溫堿性木聚糖酶。
[0011]為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0012]所述耐高溫堿性木聚糖酶的酶學性質如下:
[0013](I)溫度:該酶溫度適應范圍較寬，適用溫度范圍為40-75°C，最適反應溫度65°C，在75 °C酶活完全穩定；
[0014](2)pH:該酶適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為10.0 ;
[0015](3)酶活性:發酵液堿性木聚糖酶酶比活力較高，為350_420IU/ml ；
[0016](4)熱穩定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活；
[0017](5)存儲穩定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于3.0%。
[0018]所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下:
[0019]將保存完好的嗜熱芽孢桿菌701的斜面菌種經活化和逐級擴大培養(包括一、
二、三級種子培養以及一級種子罐培養)得到種子液，以6%接種量接入發酵罐，培養溫度37-45 °C，攪拌速度 200-70 0rpm，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間 10_15h ;然后以 1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以
1-20C/h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C，恒溫培養15-20h ;發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
[0020]所述斜面培養基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖
2-5g,瓊脂15-20g,中草藥劑粉 5-10g，蒸餾水 1000mL, pH 值 5-11，121°C滅菌 20min ；
[0021]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0022]以重量份數計，稱取黃芪20-30份，黨參10-18份，柴胡10-15份，黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0023]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。
[0024]所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0025]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0026]所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0027]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0028]所述種子罐培養基重量組成為:[0029]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥劑粉1.5-2%,海藻糖1_3%，蛋白胨
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，樺木木聚糖0.1-0.8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
[0030]所述種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0031]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥劑粉30-50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4_8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值
5-11，121°C滅菌 20min ； [0032]所述發酵培養基的調配方法為:
[0033]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節pH值5-11，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH5-ll，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0034]發酵液堿性木聚糖酶比活力為350_420IU/ml，對酶的熱穩定性進行了分析，將粗酶液分別置于40°C、45°C、50 V、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活^ 95%, 60分鐘降到85% 0 70。。下，30分鐘降到原有酶活^ 85%, 60分鐘降到80 75 °C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到70%。
[0035]本發明耐高溫堿性木聚糖酶可在造紙漂白中應用。
[0036]本發明提供的產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿菌701是從湖南省雪麗造紙廠采集土樣分離出一株嗜熱芽孢桿菌HYX0021，經反復的紫外誘變及亞硝基胍誘變篩選獲得，特性是耐高溫、耐堿性強。
[0037]本發明提供的產耐高溫堿性木聚糖酶的菌株具體為嗜熱芽孢桿菌701。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學，郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO:M2013537，分類命名為嗜熱芽孢桿菌701(Baci Ilusthermophilus701)。
[0038]本發明提供的嗜熱芽孢桿菌701是革蘭氏陽性，桿菌，好氧，產芽孢，在LB固體培養基上37°C培養24h，菌落呈圓形，菌落直徑約為1.0-2.0 mm,乳白色，表面光滑，不透明，邊緣不規則擴展。周生鞭毛，能運動，無莢膜，有芽孢，菌體大小為(0.7~0.9) μ mX (3~
3.5) μ m,芽孢(0.6~0.9) μ mX (1.0~1.5) μ m,橢圓狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。液體培養基中生長時，形成皺醭。酪蛋白水解實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗均為陽性；菌體能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用乳糖以及甘露醇；H2S、接觸酶實驗、吲哚試驗實驗均為陰性。
[0039]有益效果:
[0040]1.本發明的耐高溫堿性木聚糖酶酶比活力為350_420IU/ml ;適用溫度范圍為40-750C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩定；適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩定,最適反應pH值為10.0。比現有的耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高，耐溫度高，耐堿性強，酶作用最適PH值范圍寬泛，特別適合造紙、食品和飼料等領域的工業化需求。[0041]2.本發明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法采用梯度降溫和梯度升溫的發酵工藝顯著提高了嗜熱芽孢桿菌701的抗應激能力，致使菌株產酶能力最大限度地顯現。并且本發明對嗜熱芽孢桿菌701培養基組成實施全程優化，添加了具有抗熱應激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調整和修復機體功能、增強機體的免疫功能、具有微生態調節功能的黃芪、黨參等，進一步增強了微生物在同一發酵環境下的機體功能性、傳代適應性和共同協作性，進而增強嗜熱芽孢桿菌701的代謝功能，使得本發明所產耐高溫堿性木聚糖酶酶活力高、作用條件寬泛、穩定性強、適于工業化生產。
[0042]3.本發明耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法中培養基的重要組成部分中草藥粉劑采用酶解工藝和水提醇沉工藝相結合，不僅顯著提高了各種中草藥的有效成分，增強了中草藥的作用效力，而且還為微生物發酵提供了難得的營養物質(如中藥多糖等)。
【具體實施方式】
[0043]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0044]實施例1
[0045]耐高溫堿性木聚糖酶酶活力的測定(3，5—二硝基水楊酸比色法，簡稱DNS法)
[0046]1.試劑和溶液
[0047]1.1所用水除特別要求外，均為符合GB/6682—1992規定的三級水，化學藥品除特別要求外，均為分析純。
[0048]1.2DNS 試劑
[0049]稱取3，5—二硝基水楊酸IOg加入500ml水中，分多次加入氫氧化鈉16g，攪拌溶解(溫度< 45 °C ),再分多次加入酒石酸鉀鈉300g，攪拌至全溶，冷卻后用水定容至1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置，一周后使用(如有沉淀過濾后使用)。
[0050]1.30.lmol/L, pH5.0醋酸一醋酸鈉緩沖液
[0051]吸取冰醋酸1.8ml,加適量水，加醋酸鈉5.78g，溶解，定容至1000ml，調節PH至
5.00 ±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。
[0052]1.40.1%即lmg/ml木糖標準溶液[0053]無水木糖于80°C烘至恒重，稱取0.1OOOg于燒杯中，加適量水溶解，轉入容量瓶中并定容至100ml。
[0054]1.51.0%木聚糖溶液
[0055]稱取木聚糖1.0Og于燒杯中，用2ml0.5mol/L氫氧化鈉潤濕成糊狀，加40ml緩沖液，于60~70°C水浴中加熱溶解，冷涼后用0.5mol/L醋酸(約2ml)調pH5.0，轉入容量瓶中，加緩沖液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置時間長了出現沉淀，使用前應在熱水浴中熱溶。
[0056]1.6木糖標準曲線的繪制
[0057]吸取lmg/ml木糖溶液0，0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0ml于試管中，補水至2ml,加DNS試劑3ml，混合后于沸水中煮lOmin，冷卻后定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光度(A)。以吸光度為縱坐標，木糖量為橫坐標，繪制標準曲線，三次重復試驗的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y = ax + b,求出吸光度與木糖量的關系。
[0058]2.待測酶樣品的處理
[0059]直接吸取酶液做適當稀釋，使測定光吸收值在0.25—0.4范圍內。
[0060]3.酶活力測定
[0061]取15ml具塞刻度試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(吸取前搖勻)(1.5)開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，50°C水解1Omin.[0062]反應步驟及試劑、溶液用量見下表:
[0063]
【權利要求】
1.一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶的酶學性質如下: (1)溫度:適用溫度范圍為40-75°C，最適反應溫度65°C，在75°C酶活完全穩定； (2)pH:該酶適用反應pH值范圍為5.0-11.0，在pH值為11.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為10.0 ； (3)酶活性:發酵液堿性木聚糖酶酶比活力為350-420IU/ml； (4)熱穩定性:該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活； (5)存儲穩定性:該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于3.0%。
2.如權利要求1所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶由嗜熱芽孢桿菌CCTCC M2013537經液體深層發酵制備。
3.如權利要求2所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下:將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M2013537的斜面菌種經活化和一、二、三級種子培養以及一級種子罐培養逐級擴大培養得到種子液，以6%接種量接入發酵罐，培養溫度37-45°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3,培養時間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以1-2 °C /h升溫速率緩慢升溫至10-15 °C，恒溫培養15_20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C，恒溫培養15-20h ;發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥劑粉。
4.如權利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述種子培養基重量組成為:酵 母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
5.如權利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述種子罐培養基重量組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥劑粉1.5-2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，樺木木聚糖0.1-0.8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°c滅菌30_40min。
6.如權利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述種子罐發酵液菌體濃度為 7.0x108-8.0xlO8 個 /ml ο
7.如權利要求3所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥劑粉30_50g，海藻糖30_40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l_5g，消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 1000mL, pH 值 5-11，121°C滅菌 20min。
8.如權利要求3-7任一所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度W V~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
9.如權利要求8所述的一種耐高溫堿性木聚糖酶，其特征在于，所述混合酶的重量份數組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5_10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如權利要求1或2所述的一種`耐高溫堿性木聚糖酶在造紙漂白中的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK103865903SQ201310685095
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】李洪兵, 朱永明, 孫明芳, 劉波, 易繼云, 周俊 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司