一種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法
【專利摘要】一種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法，按如下步驟：將藻渣用硫酸進(jìn)行兩步水解；將藻渣水解液配成微藻生長的培養(yǎng)液；將微藻藻種接種于上述培養(yǎng)液中，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)；用正己烷和乙醇提取油脂。本發(fā)明培養(yǎng)過程操作簡單，生產(chǎn)成本低，油脂產(chǎn)率高，無環(huán)境污染，可規(guī)模化，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化，提供一種新的微藻產(chǎn)油模式，是一種滿足工業(yè)化需求、實(shí)用性很強(qiáng)的新方法。
【專利說明】一種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻油脂，又稱單細(xì)胞油脂，是制備生物柴油的良好原料。部分微藻富含油脂等代謝產(chǎn)物，其油脂可用來制備生物柴油。與其他油料作物相比，利用微藻培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油具有以下優(yōu)勢。首先，利用微藻培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油所需占地面積最少，同時微藻培養(yǎng)可以利用灘涂地、荒廢地等非耕地，因此微藻培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油不會導(dǎo)致世界糧食供應(yīng)問題。從所需用地面積占全球總面積角度看，利用微藻油脂作為原料生產(chǎn)的生物柴油是目前最有可能滿足世界運(yùn)輸所需燃料的可再生能源。此外，微藻還能通過光合作用固定CO2合成油脂，可實(shí)現(xiàn)CO2減排。再者，微藻生長過程能利用廢水中的N、P等物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)廢水的凈化。微藻油脂制備的生物柴油與其他油料作物制備的生物柴油及石油基柴油在性能方面差異不大利用微藻油脂這一新的油脂資源，可實(shí)現(xiàn)能源和環(huán)境的和諧而可持續(xù)發(fā)展。[0003]微藻細(xì)胞除含油脂外，還含大量的碳水化合物，蛋白質(zhì)等，因此在微藻制備高品質(zhì)生物柴油過程中會產(chǎn)生大量的殘余物質(zhì)，以上物質(zhì)若不加以利用將造成藻體殘?jiān)邇r值多元組成的浪費(fèi)和環(huán)境污染。實(shí)際上，藻體殘?jiān)侵匾纳镔|(zhì)資源。首先，微藻一直是水產(chǎn)餌料。理論上，油脂提取后的藻渣可用作水產(chǎn)餌料，但目前一般采用有機(jī)溶劑大規(guī)模提取微藻油脂，藻渣中往往會殘留有機(jī)溶劑；若將藻渣用作水產(chǎn)動物餌料，將對水產(chǎn)動物生長造成嚴(yán)重影響，甚至引起水產(chǎn)動物死亡。此外，可以將藻渣轉(zhuǎn)化成高附加值產(chǎn)品，即從藻渣中提取多糖、色素、生長因子等活性成分。再者，可以通過微生物轉(zhuǎn)化直接將藻渣發(fā)酵成沼氣或氫氣或?qū)⒃逶c秸桿共發(fā)酵產(chǎn)沼氣或氫氣等。
[0004]21世紀(jì)初，世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，石油枯竭和價格上漲，美國等發(fā)達(dá)國家的政府和企業(yè)域紛紛投入大量資金并計(jì)劃投入巨資進(jìn)行微藻生物柴油中試和產(chǎn)業(yè)化，在國際上掀起了一股勢不可擋的微藻生物柴油開發(fā)熱潮。2007年，美國宣布由國家能源局支持的微型曼哈頓計(jì)劃，計(jì)劃在2010年實(shí)現(xiàn)微藻制備生物柴油工業(yè)化，各項(xiàng)技術(shù)研發(fā)全面提速。美國還制訂了微藻生物燃料技術(shù)路線圖。在2008年12月flO日的會議上提出了實(shí)現(xiàn)商業(yè)規(guī)模微藻生物燃料工業(yè)的難關(guān)和戰(zhàn)略，指導(dǎo)在微藻科學(xué)與工程領(lǐng)域里微藻的培育、生產(chǎn)、加工和轉(zhuǎn)化；并制訂了技術(shù)經(jīng)濟(jì)模型，用于指導(dǎo)研發(fā)、政策、商業(yè)發(fā)展的決策。一些發(fā)達(dá)國家也都紛紛啟動了微藻生物柴油方面的科研項(xiàng)目，目前全球已有150多家專門從事微藻生物柴油開發(fā)研究的公司，可以說微藻生物柴油已經(jīng)成為世界各國重點(diǎn)研究的戰(zhàn)略方向。美國能源部(DOE)每年投資數(shù)百萬美元以推進(jìn)該項(xiàng)目的商業(yè)化進(jìn)程。目前微藻產(chǎn)生物柴油尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，目前生產(chǎn)方式微藻產(chǎn)油效率比較低，還沒有發(fā)現(xiàn)一種可將提油后藻渣充分利用的方法。本專利即為一種利用提油后藻渣水解液培養(yǎng)微藻生產(chǎn)油脂的方法，大大提高微藻產(chǎn)油效率，該工藝路線尚未有文獻(xiàn)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中提油后藻渣未被充分利用，自養(yǎng)微藻油脂產(chǎn)率低，微藻生物能源生產(chǎn)系統(tǒng)成本偏高的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法，該方法高效產(chǎn)油、藻渣水解效率高、微藻油脂生產(chǎn)成本大大降低、藻渣水解液利用效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、操作過程簡單。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]—種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法，其特征在于按以下步驟。
[0008](I)將藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.廣5%的稀硫酸以1:1飛的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度8(T20(TC，時間2~10分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C,水解24小時,反應(yīng)結(jié)束后得到藻洛水解液。
[0009](2)將藻渣水解液配成微藻生長的培養(yǎng)液:水與藻渣水解液之比為擴(kuò)4:1，并加入10(T800mg/L的硝酸鈉或氯化銨，l(T35000mg/L的氯化鈉和l(Tl50mg/L的磷酸二氫鈉，高氯化鈉含量有助于抑制帶菌微藻培養(yǎng)過程中其他微生物生長。
[0010](3)將微藻藻種接種于步驟(2)的培養(yǎng)液中，置于敞開式或密閉式反應(yīng)器生長，培養(yǎng)過程中溫度25~30°C、pH 6.(T9.0、通氣量0.1~?.0vvm,自然光或人工光光照強(qiáng)度500-50001Χ，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)。培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始5~7天，培養(yǎng)液中碳源較充足，故使用低濃度CO2為f 3% ;培養(yǎng)后期為51天CO2濃度調(diào)高至10%~40%，強(qiáng)化碳源的供給；通過CO2濃度改變來改變培養(yǎng)液中C、N比而促進(jìn)微藻生物質(zhì)和油脂積累，低C、N比有利于小球藻積累生物質(zhì)，高C、N比有利于微藻積累油脂；C02濃度改變通過空氣和沼氣發(fā)酵產(chǎn)生的CO2在氣體混合裝置中混合來實(shí)現(xiàn)。
[0011](4)收集步驟(3)中的微藻，用水沖洗，經(jīng)微波爐預(yù)處理(8(Tl50°C，150(T3000MHz，3~15分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:f 3，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度3(T50°C，轉(zhuǎn)速20-80轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。
[0012]本發(fā)明步驟(4)所述的微波爐預(yù)處理的最優(yōu)方案是120°C，2500MHz，10分鐘。
[0013]本發(fā)明利用高效液相色譜儀檢測藻渣水解液中糖含量，用氨基酸分析儀測定藻渣水解液中氨基酸含量，用紫外分光光度計(jì)測定微藻生物量，用正己烷和乙醇提取油脂，烘干后用電子天平測油脂重量。
[0014]本發(fā)明微藻油脂的生產(chǎn)是利用藻渣，微藻培養(yǎng)過程通入CO2可調(diào)控油脂積累代謝，提高油脂產(chǎn)率，培養(yǎng)過程操作簡單，生產(chǎn)成本低，無環(huán)境污染，可規(guī)?；?，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化，提供一種新的微藻產(chǎn)油模式，是一種滿足工業(yè)化需求、實(shí)用性很強(qiáng)的新方法。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0016]以下實(shí)施例所用到的小球藻，可從中國典型微生物保藏中心(武漢)獲得，其保藏編號為CCTCC M209256 ;所用到的微擬球藻、原核小球藻和雨生紅球藻，可從美國德州大學(xué)UTEX藻種庫獲得，其保藏編號分別為LB2164、256和2505;所用到的萊茵衣藻，可從中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫獲得，其保藏編號為FACHB-265。
[0017]實(shí)施例1。
[0018]將小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):氯化鈉24000，Na2EDTA 10，F(xiàn)eSO4.7Η20 50,KH2PO4 20,MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度20001x，培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g小球藻，離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用蒸餾水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2，水相經(jīng)離心(15000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比3的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度180°C，時間3分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C，水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0019]將藻渣水解液配成小球藻生長的培養(yǎng)液:自來水與藻渣水解液之比為7:1，并加入300mg/L的硝酸鈉,30000mg/L的氯化鈉和50mg/L的磷酸二氫鈉。將小球藻藻種接種于滅菌后含藻洛水解液的培養(yǎng)液中置于密閉圓柱狀反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度30°C、pH 7.0、通氣量0.5vvm,白熾燈光照強(qiáng)度30001x，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始5天，使用的CO2濃度為3% ;培養(yǎng)后期為5天，期間CO2濃度調(diào)至30%，培養(yǎng)結(jié)束后；離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:1，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度35°C，轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0020]實(shí)施例2。
[0021]將原核小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):蛋白胨1000, NaCl 25,CaCl2.2Η20 25，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7Η20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，光照強(qiáng)度50001x，`培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g原核小球藻，絮凝(FeCl3.6H20，加入量50 mg/L)收集獲得藻體，用蒸餾水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:1，水相經(jīng)離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比I的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度100°C，時間10分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C，水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0022]將藻渣水解液配成微擬球藻生長的培養(yǎng)液:蒸餾水與藻渣水解液之比為1:1，并加入100mg/L的氯化銨,35000mg/L的氯化鈉和50mg/L的磷酸二氫鈉。將微擬球藻藻種接種于滅菌后含藻渣水解液的培養(yǎng)液中置于密閉圓柱狀反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度25°C、pH 8.0、通氣量0.3vvm、太陽光光照強(qiáng)度50001x，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始5天，使用的CO2濃度為1% ;培養(yǎng)后期為5天，期間CO2濃度調(diào)至20%，培養(yǎng)結(jié)束后；絮凝(FeCl3.6H20，加入量50 mg/L)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:2，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度40°C，轉(zhuǎn)速40轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0023]實(shí)施例3。
[0024]將雨生紅球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L) =NaCl 25，Na2EDTA 50，F(xiàn)eSO4.7H20 4.98，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75，ZnSO4.7H20 8.82，CaCl2.2H2025，CuSO4.5H20 1.57，MnCl2 1.44，MoO3 0.71，H3BO3 11.42，KOH 31 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度50001x，培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g雨生紅球藻，過濾(濾膜直徑0.δμπι)收集獲得藻體，用自來水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:3，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用自來水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比3的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度180°C，時間3分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C，水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0025]將藻渣水解液配成小球藻生長的培養(yǎng)液:自來水與藻渣水解液之比為7:1，并加入800mg/L的硝酸鈉,30000mg/L的氯化鈉和50mg/L的磷酸二氫鈉。將小球藻藻種接種于滅菌后含藻洛水解液的培養(yǎng)液中置于密閉圓柱狀反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度30°C、pH 8.0、通氣量0.5vvm、白熾燈光照強(qiáng)度20001x，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始7天，使用的CO2濃度為2% ;培養(yǎng)后期為8天，期間CO2濃度調(diào)至25%，培養(yǎng)結(jié)束后；過濾(濾膜直徑0.5 Mm)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為 I:1:3，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度35°C，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0026]實(shí)施例4。
[0027]將微擬球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 30000, Na2EDTA 20，F(xiàn)eSO4.7Η20 30，NaH2PO4 30，MgCl2 20和NaNO3 200置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度20001x，培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g微擬球藻，離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用自來水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:3，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用自來水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比3的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度180°C，時間3分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C，水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0028]將藻渣水解液配成原核小球藻生長的培養(yǎng)液:蒸餾水與藻渣水解液之比為7:1，并加入300mg/L的硝酸鈉,25 mg/L的氯化鈉和100mg/L的磷酸二氫鈉。將原核小球藻藻種接種于滅菌后含藻渣水解液的培養(yǎng)液中置于密閉圓柱狀反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度30°C、pH
8.0、通氣量0.5vvm,白熾燈光照強(qiáng)度2000 lx，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始7天，使用的CO2濃度為2% ;培養(yǎng)后期為8天，期間CO2濃度調(diào)至15%，培養(yǎng)結(jié)束后；離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:3，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30°C，轉(zhuǎn)速40轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0029]實(shí)施例5。
[0030]將萊茵衣藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 25，Na2EDTA 0.05，F(xiàn)eCl3.6Η20 0.5, K2HPO4 75, KH2PO4 175，MgSO4.7Η20 75 和 NaNO3 250 置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26°C，光照強(qiáng)度3000 lx，培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g萊茵衣藻，離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用自來水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為I:1:3，水相經(jīng)離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用自來水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比3的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度180°C，時間3分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，110°C，水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0031]將藻渣水解液配成小球藻生長的培養(yǎng)液:自來水與藻渣水解液之比為7:1，并加入200mg/L的氯化銨,20000mg/L的氯化鈉和100mg/L的磷酸二氫鈉。將小球藻藻種接種于含藻渣水解液的培養(yǎng)液中置于敞開式平板反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度30°C、pH 8.0、通氣量
0.5vvm、太陽光光照強(qiáng)度40001x，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始7天，使用的CO2濃度為2% ;培養(yǎng)后期為8天，期間CO2濃度調(diào)至10%，培養(yǎng)結(jié)束后；離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz, 10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為I:1:2，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度35°C，轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0032]實(shí)施例6。
[0033]將小球藻藻種經(jīng) 無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):氯化鈉24000，Na2EDTA 10，F(xiàn)eSO4.7Η20 50，NaH2PO4 20，MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度20001χ，培養(yǎng)10天。在光照培養(yǎng)箱中生長的100g小球藻，離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用蒸餾水沖洗5次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz，10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1:1，水相經(jīng)離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到藻渣，藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀硫酸以I比I的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度100°C，時間10分鐘，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，IlO0C,水解24小時，反應(yīng)結(jié)束后得到藻渣水解液；檢測其中糖和氨基酸含量。
[0034]將藻渣水解液配成微擬球藻生長的培養(yǎng)液:蒸餾水與藻渣水解液之比為1:1，并加入800mg/L的硝酸鈉，25000mg/L的氯化鈉和50mg/L的磷酸二氫鈉。將微擬球藻藻種接種于含藻渣水解液的培養(yǎng)液中置于敞開式平板反應(yīng)器生長，培養(yǎng)溫度25°C、pH 7.0、通氣量
0.3vvm、太陽光光照強(qiáng)度50001x，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng)，培養(yǎng)前期為培養(yǎng)起始5天，使用的CO2濃度為1% ;培養(yǎng)后期為5天，期間CO2濃度調(diào)至20%,培養(yǎng)結(jié)束后；離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)收集獲得藻體，用水沖洗3次，經(jīng)微波爐預(yù)處理(120°C，2500MHz, 10分鐘)后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為I:1:2，其中有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度35°C，轉(zhuǎn)速30轉(zhuǎn)/分鐘)去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。結(jié)果見表1。
[0035]對比例I。
[0036]將小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):氯化鈉24000，Na2EDTA 10，F(xiàn)eSO4.7Η20 50，NaH2PO4 20，MgCl2 20和NaNO3 100置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度20001χ，培養(yǎng)10天。分析生物量及油脂產(chǎn)率，結(jié)果見表1。[0037]對比例2。
[0038]將微擬球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 30000, Na2EDTA 20，F(xiàn)eSO4.7Η20 30，NaH2PO4 30，MgCl2 20和NaNO3 200置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度250C，光照強(qiáng)度20001χ，通氣量0.5vvm, CO2濃度為2%，培養(yǎng)10天。分析生物量及油脂產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
[0039]對比例3。
[0040]將原核小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌培養(yǎng)基(mg/L):NaCl 25, CaCl2.2H2025，K2HPO4 75，KH2PO4 175，MgSO4.7H20 75和NaNO3 250置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，光照強(qiáng)度20001χ，培養(yǎng)15天。分析生物量及油脂產(chǎn)率，結(jié)果見表1。
[0041]表1實(shí)施例及對比結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種利用提油后藻渣生產(chǎn)微藻油脂的方法，其特征是按如下步驟: (1)將藻渣與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.f 5%的稀硫酸以1:1飛的質(zhì)量比混合均勻，置于反應(yīng)釜中，反應(yīng)溫度8(T200°C，時間2~lOmin，然后再加入濃鹽酸進(jìn)一步水解，水解條件:6mol/L鹽酸，1lO0C,水解24h，反應(yīng)結(jié)束后得到藻洛水解液； (2)將藻渣水解液配成微藻生長的培養(yǎng)液:水與藻渣水解液之比為擴(kuò)4:1，并加入10(T800mg/L的硝酸鈉或氯化銨、l(T35000mg/L的氯化鈉和l(Tl50mg/L的磷酸二氫鈉； (3)將微藻藻種接種于步驟(2)的培養(yǎng)液中，置于敞開式或密閉式反應(yīng)器生長，培養(yǎng)過程中溫度25~30°C、pH 6.(T9.0、通氣量0.1-1.0vvm,自然光或人工光光照強(qiáng)度500~5000lx，光暗周期12/12，采用基于CO2濃度的兩步法培養(yǎng):培養(yǎng)前期5~7天，CO2濃度為f 3% ;培養(yǎng)后期5~8天，CO2濃度調(diào)至10%~40% ； (4)收集步驟(3)中的微藻，用水沖洗，經(jīng)8(Tl50°C、150(T3000MHz、3~15分鐘微波爐預(yù)處理后，用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預(yù)處理后的藻漿體積比為1:1: f 3，其中有機(jī)相溫度3(T50°C、轉(zhuǎn)速20-80轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除有機(jī)溶劑后，去雜，干燥，得到油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的生產(chǎn)微藻油脂的方法，其特征是步驟(4)所述的微波爐預(yù)處理?xiàng)l件為:120°C、2500MHz、10分鐘。
【文檔編號】C12P7/64GK103695482SQ201310683878
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】鄭洪立, 阮榕生, 劉玉環(huán), 高振, 彭紅, 黃和, 劉君英, 張錦勝 申請人:南昌大學(xué)