富含dha及dpa的油脂及其制備和應用的制作方法

富含dha及dpa的油脂及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種富含多不飽和脂肪酸油脂及其制備和應用，特別是指富含DHA及DPA的油脂及其制備和應用。在一個含有發酵培養基的通氣發酵罐中，在機械攪拌的方式下培養裂壺藻；培養結束后收集藻體細胞；從藻體細胞中提取回收富含多不飽和脂肪酸的油脂；連續培養過程包括連續流加培養基質、細胞的截留返回、發酵液的放流等工藝步驟。富含DHA及DPA的油脂可以用于制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑及藥品。本發明解決了現有技術中存在的細胞活性低、生產周期長等問題，具有細胞活性高、生長周期短、不飽和脂肪酸產量高等優點。
【專利說明】富含DHA及DPA的油脂及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種富含多不飽和脂肪酸油脂及其制備和應用，特別是指富含DHA及DPA的油脂及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]多不飽和脂肪酸是人體必需的營養物質，攝取不足會造成身體機能不適。它們可保持細胞膜的相對流動性，保持細胞的正常生理功能，也可以降低甘油三酯，改善微循環，促進腦和神經細胞發育，增強記憶和思維能力。長鏈多不飽和脂肪酸中最重要的有DHA (二十二碳六烯酸)和DPA (二十二碳五烯酸)。
[0003]DHA是人腦的主要組成物質之一，約占大腦灰質磷脂的24.3%_36.6%。DHA可促進腦細胞的分裂、增殖、突起的生長和神經網絡的形成，有利于智力、學習和記憶能力的提高。
[0004]DHA具有調節中樞神經系統的功能，體內DHA的含量與嬰幼兒成長過程中的反應靈敏程度、早產兒出生后的生長呈正相關。如果出生后，早產兒的膳食中不能提供足夠的DHA，就會對早產兒的生長發育帶來極為不利的影響。DHA在人的視網膜中含量豐富，是神經和視覺發育的一種必要營養素，它可以提高嬰幼兒視覺的敏銳度。嬰幼兒膳食中若缺乏DHA，視網膜的DHA含量減少，對光的視覺敏感性會受到影響，視力會降低。
[0005]DHA可以降血壓，調節人體內血脂和脂蛋白的正常代謝，降低血液粘稠度和血液中膽固醇水平，預防心血管疾病。DHA還是一種中樞神經保護素的前體，能夠促進人腦的綜合代謝活力同時減緩神經退化性疾病的進程，對老年人有防止老年癡呆癥的作用。近些年來有研究也發現了二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,簡稱DPA)對膽固醇的吸收和代謝方面的的生理功效，指出DPA可以降低血清總膽固醇和非高密度脂蛋白膽固醇，同時DPA和DHA對于大動脈的功能也有一定的改善作用。
[0006]有關這些長鏈多不飽和脂肪酸的生理功能及其實際應用的研究已有較多報道。傳統的長鏈多不飽和脂肪酸多是從深海魚油中提取的，但是由于從魚油中提取的PUFA含有強烈的魚腥味，而且魚油中脂肪酸成份復雜，DHA的分離提取過程不僅步驟多而且損失大，所以現在有很多專利是用來申請PUFA分離及純化方法的。而且近期也有研究調查指出，魚油中所含有的持續性有機污 染物(POPs)及其危害多年來一直被人們所忽視。持續性有機污染物(POPs)是指在海洋中需要幾十年或更長時間才能降解消失的污染物，如人們所熟悉的滴滴涕(DDT)、其它化學殺蟲劑、多氯聯苯類物質(PCBs)、二惡英(Dioxin)和六氯苯(HCB)等等，這些物質對人體的健康有極大的危害，可以干擾人體內分泌系統、損害神經系統、影響成年人的生育能力以及誘發和促進癌細胞生長發育。此外魚油還含有如汞等重金屬化合物，對孕婦、哺乳期婦女和兒童有很大的傷害。目前多不飽和脂肪酸，特別是DHA的另一個來源是海洋微藻油。從海洋生物的食物鏈來看，藻類是魚類的最基本食物，研究表明魚體內的多不飽和脂肪酸來源于藻類。
[0007]因此利用藻類工業化高效生產DHA具有重要的技術和市場需求。
[0008]微藻細胞可以采用以下培養方式:分批式培養、流加分批式培養和連續培養。分批式培養是將底物基質一次性投加到發酵罐中，將預先培養好的種子培養液接種到發酵罐中，在適宜的條件下培養，反應完成后將全部反應物料取出的操作方式。目前，發酵制品的生產中多采用這種方式。流加分批操作是指先將一定量的發酵底物基質投加到發酵罐中，接種微生物并在適宜的條件下培養一段時間，之后開始按一定要求流加特定的底物基質，當反應終止時取出全部的反應物料的操作方式。連續發酵培養是指底物基質不斷流加入發酵罐內，同時又把反應物料連續不斷的取出，發酵罐內的反應液體積保持恒定，反應條件不隨時間變化的操作方式。分批式發酵因其設備制作費用低，設備的通用性高，是發酵工業中使用廣泛的方法之一，但是反應器的非生產周期長，每批發酵結束后都需進行洗罐和滅菌，由于頻繁的高溫高壓滅菌，易使檢測裝置損傷及設備的腐蝕等損害，而且，種子逐級放大培養過程中任何一級發酵罐染菌均會造成經濟損失和生產周期的延遲。分批發酵過程中隨培養的進行，底物濃度下降，細胞濃度增加，產物濃度增加，細胞活性逐步降低。流加分批式發酵可以控制反應器中底物基質的濃度，確保細胞生長所需的條件，產率可提高。但分批式流加受罐體積所限，持續的時間短，仍然不能克服非生產周期長的問題。相比之下，連續發酵更容易實現機械化和自動化節約勞動力，減少人工操作帶來的污染，只在發酵之初對發酵罐進行一次滅菌后便可長期運行，避免頻繁滅菌對設備的損害，也省去了頻繁的種子培養過程。因為底物基質的不斷添加和反應液的不斷排出，可控制發酵罐內代謝產物的濃度，避免底物限制和代謝產物抑制作用，保持了細胞的活性和生長速率。 [0009]在本專利申請之前，尚未有利用連續培養方式進行藻類多不飽和脂肪酸生產的中國專利，現有的專利均是利用分批或流加分批培養，如CN101979623A和ZL01806451.5。通過分批補充某種物質誘導產生脂質。但在這個培養系統中，誘導脂質產生的營養限制條件使得培養過程缺少了細胞生長所必需的營養物質，影響了細胞濃度，造成產量的下降，因為細胞在生長過程中，必需有足夠的營養物質或溶解氧的供給才能維持細胞量的增長，而不是限定在某種水平或降低。同時，細胞培養過程中通過新陳代謝作用產生代謝副產物，而這些物質對細胞的生長有負作用，可導致細胞生長速度下降，因此在現有的專利中，所要求的培養技術沒有消除培養系統中后期代謝所產生的毒副產物的積累問題，毒副產物一直保留在培養系統中，從而不能達到細胞的高效連續培養。
[0010]微藻油脂生產的目標物為胞內產物，而非胞外分泌物，發酵培養的主要目的是收獲高油脂含量的細胞，所以提高發酵液中的細胞生物量是優化發酵條件的主要考慮因素之一。裂壺藻(Schizochytrium)在無性繁殖過程中，每個營養細胞經過分裂釋放2_8個游動孢子，這些孢子成熟后又經過細胞分裂使細胞數目成倍增加。因此，最終細胞量的生產和脂肪酸的積累是和細胞的生長及活性相關。微生物發酵過程的連續培養通常都是在連續流入培養基的同時流出反應液，以維持罐內一定的反應液體積、細胞濃度和營養物質濃度，所以隨著反應液不斷排出的同時也造成細胞的流失，短期內罐內可收集的細胞濃度是較低的。
[0011]發明目的
[0012]本發明的目的在于提供一種富含DHA及DPA的油脂及其制備和應用，通過連續流加基質和排出反應液有利于解除發酵底物限制和產物抑制導致的細胞活性降低，避免細胞生長進入停滯期和衰老期，有利于維持發酵罐內細胞的活性和脂肪酸的積累；并將該富含DHA及DPA的油脂用于制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑、功能食品以及藥品。[0013]本發明的整體技術構思是:
[0014]富含DHA及DPA的油脂，該油脂中不飽和脂肪酸DHA和DPA分別占總脂肪酸質量百分比的25-55%以及5-20%。
[0015]富含DHA及DPA的油脂的制備方法，在一個含有發酵培養基的通氣發酵罐中，在機械攪拌的方式下培養裂壺藻；培養結束后從發酵罐中收集藻體細胞；從所述的藻體細胞中提取回收所述的富含多不飽和脂肪酸的油脂；所述的培養為連續培養，連續培養過程包括如下工藝步驟:
[0016]A、連續流加培養基質:培養基質泵入發酵罐，發酵液由出料泵經出料口泵出罐外；
[0017]B、細胞的截留返回:步驟A中的發酵液進入封閉無菌的固液分離裝置進行細胞與發酵培養基分離，分離后的細胞濃縮液泵回發酵罐；
[0018]C、發酵液的放流:當發酵罐內的細胞達到額定濃度時，將發酵罐內的部分培養基排出。
[0019]富含DHA及DPA的油脂在制備普通食品添加劑、特殊膳食食品添加劑、藥品中的應用。
[0020]本發明的具體技術構思還有: [0021]步驟A是發酵過程中當發酵培養基中碳源濃度為5-20克/升時，開始將培養基質泵入發酵罐并維持罐內5-20克/升的碳源濃度。
[0022]所述的步驟A培養基質中碳源的添加比例高于其他營養物質，其他營養物質選自氮源，維生素，磷酸鹽，微量元素及其混合物。
[0023]步驟B中細胞與發酵培養基的分離采用固液分離裝置。
[0024]步驟B中細胞濃縮液由發酵罐底部灌流回發酵罐內。
[0025]優選的實施方式是，所述的培養過程的溫度為20°C -35°C。
[0026]所述的連續培養過程發酵培養基的溶解氧含量為5%_60%飽和度。
[0027]所述的裂壺藻優選裂壺藻CGMCCN0.7693。
[0028]本發明中所米用的裂壺藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，該保藏單位的地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0029]可以顯而易見的是，為縮短發酵周期、降低發酵成本，常見的技術實現方式是，所述的培養是將裂壺藻原始藻種經活化、擴大培養后制成種子液，將種子液接種至發酵培養基進行培養。
[0030]所述裂壺藻的活化傳代培養基采用如下組分組成:
[0031]葡萄糖10-30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化鈉15_25g/L，硫酸鎂 l_5g/L，磷酸二氫鉀 0.5-5g/L,氯化鉀 0.Ι-lg/L,氯化鈣 0.01-0.6g/L,硫酸銨 0.5_3g/L,碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化錳0.01-lmg/L，三氯化鐵 0.5-3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化鈷0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，余量為水，瓊脂 10g/L, pH=6_7。
[0032]所述的裂壺藻的擴培、發酵培養基、流加培養基質采用如下組分組成:[0033]葡萄糖40_60g/L，酵母提取物5_20g/L，氯化鈉10_20g/L，硫酸鎂l_5g/L，磷酸二氫鉀0.5-5g/L,氯化鉀0.Ι-lg/L,氯化鈣0.01-0.6g/L,硫酸銨0.5_3g/L，碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,氯化錳0.01-lmg/L,三氯化鐵0.5_3mg/L，氰鈷胺素5_50mg/L，氯化鋅0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化鈷 0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20-60mg/L，余量為水，pH=6-7。可以顯而易見的是，在發酵過程中按需添加適量消泡劑，以維持發酵過程的正常進行。
[0034]本發明總脂的測定采用傳統的溶劑浸提法，根據經典的Bligh-Dyer脂肪酸提取及酯化方法，稱取一定量的凍干細胞，與甲醇:氯仿:水=1:2:0.8的混合液一起攪拌30分鐘，離心后收集上清液，反復清洗數次后合并上清液，用氮氣吹干溶劑得到藻細胞的脂，稱重，測得總脂含量。取適量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液及一定量17烷酸的內標物與三氟化硼-乙醚，由此進行甲酯化，從而得到多不飽和脂肪酸甲酯，進行氣相色譜測定。 [0035]本發明所具備的實質性特點和取得的顯著技術進步在于:
[0036]本發明在反應液流出端口增加細胞捕獲反流裝置富集細胞，再將細胞濃縮液返回發酵罐。利用沉降-逆灌流偶聯的細胞連續培養方式，通過連續流加基質和排出反應液的方式，有利于解除發酵底物限制和產物抑制導致的細胞活性降低的問題，避免細胞生長進入停滯期和衰老期，有利于維持發酵罐內細胞的活性和脂肪酸的積累。進而通過細胞本身的生長特性自然誘導脂質產生，從而達到較高的多不飽和脂肪酸生產量。細胞截留返回避免了細胞流失，維持了發酵罐內高細胞濃度，同時補充基質，節省了發酵罐接種后的延遲期，縮短了生產周期。這一方法可維持發酵罐中較高的細胞濃度，高效生產所需的產物。
[0037]在現有技術中DHA及DPA已被文獻報道可應用于制備食品添加劑、功能食品、保健品甚至預防心腦血管等藥品的制備，本發明中所述的富含DHA及DPA的油脂經檢測符合相關的產品要求，且已有相關的產品出售，因此， 申請人:不再對其用于制備食品添加劑、功能食品、保健品甚至藥品的制備方法進行贅述。
[0038]本發明中所米用的裂壺藻(Schizochytrium sp.)CGMCCN0.7693已于2013年6月9日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏。
【具體實施方式】
[0039]以下結合實施例對本發明做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據說明書做出的等效技術手段替換，均不脫離本發明的保護范圍。本發明中的固液分離裝置采用了簡易的細胞沉降槽和中空纖維過濾膜，但不限于這兩種裝置，對于采用更先進的沉降型固液分離裝置和膜過濾型固液分離裝置也屬于本發明的保護范圍。
[0040]實施例1
[0041]微藻藻種的保藏培養:本實施例中的藻種選用裂壺藻(Schizochytriumsp.)CGMCCN0.7693。其在固體培養基上可以正常生長，所以藻種傳代活化采用半天然化學合成培養基進行。所述的裂壺藻活化傳代培養基采用如下組分組成:
[0042]葡萄糖10g/L,胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,氯化鈉15g/L,硫酸鎂lg/L,磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鉀0.lg/L，氯化鈣0.01g/L，硫酸銨0.5g/L，碳酸氫鈉0.01g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10mg/L,硼酸10mg/L,氯化猛0.01mg/L,三氯化鐵0.5mg/L,氰鈷胺素5mg/L,氯化鋅0.lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基_5_嘧啶基)-甲基]_5_ (2-羥基乙基)_4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化鈷0.01mg/L,硫酸銅0.01mg/L,瓊脂10g/L,余量為水，pH=6_7。
[0043]培養基配好后，121°C蒸汽滅菌20分鐘。轉接后的藻種于20-30°C培養箱靜置培養4天后，觀察菌落形態和顯微鏡鏡檢，以確保藻種無雜菌污染。
[0044]所述的裂壺藻的擴培、發酵培養基、流加培養基質采用如下組分組成:
[0045]葡萄糖40g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉10g/L,硫酸鎂lg/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,氯化鉀0.lg/L,氯化鈣0.01g/L,硫酸銨0.5g/L，碳酸氫鈉0.01g/L,氯化錳0.01mg/L,三氯化鐵0.5mg/L,氰鈷胺素5mg/L，氯化鋅0.lmg/L,氯化3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5_ (2-羥基乙基)-4_甲基噻唑0.5mg/L,氯化鈷0.01mg/L,硫酸銅0.01mg/L,硼酸10mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20mg/L，余量為水，pH=6_7。
[0046]將平板活化的藻種接種于裝有50ml活化傳代培養基的250ml三角瓶中，在溫度為30°C、轉速為150轉/分鐘條件下搖瓶培養36小時，以質量百分含量為10%的接種量轉接入裝有100ml擴培培養基的500ml三角瓶中，繼續培養48小時，經過連續兩次的傳代擴培后，接種到30°C的2L發酵罐中，pH控制在6-7之間，培養過程中酸堿度的控制由向發酵罐添加0.5M的氫氧化鈉溶液或0.5M的鹽酸溶液完成，通氣量為1.5L/min,攪拌轉速為350轉/分鐘。在發酵過程中按需添加適量消泡劑，以維持發酵過程的正常進行。當葡萄糖濃度降為10g/L時，開始進行連續流加和細胞沉降逆灌流耦合。初始流加速度為0.3ml/min,調節通氣量和攪拌速度，控制溶氧量為10%。隨發酵進行，發酵罐內細胞濃度和耗糖速度增加，發酵過程中控制進料泵的流速，維持罐內葡萄糖濃度在10g/L左右。發酵罐泵出反應液的出口處連接容積為1.5L的細胞沉降槽，所述微藻的沉降速率為2-3cm/min，沉降細胞回流速度為30ml/min，廢液以與料液相同的流加速度排出罐外，以避免發酵液的溢出。發酵罐內細胞干重濃度達到39.56g/L時，放流三分之一體積的發酵液，并收集細胞。放流后，發酵罐以0.5ml/min的速度繼續流加培養基直到恢復原體積，并控制進料泵的流速，維持罐內葡萄糖濃度在10g/L。如此反復三次放流。三次放流收集藻細胞，富含DHA及DPA的油脂采用常規方法從藻細胞中提取，分別進行分析測試。DHA的產量為9.47±0.97g/L, DPA的產量為3.11±0.77g/L。細胞內主要脂肪酸的組成如下表所示。
[0047]
【權利要求】
1.富含DHA及DPA的油脂，其特征在于該油脂中不飽和脂肪酸DHA和DPA分別占總脂肪酸質量百分比的25-55%以及5-20%。
2.富含DHA及DPA的油脂的制備方法，在一個含有發酵培養基的通氣發酵罐中，在機械攪拌的方式下培養裂壺藻；培養結束后從發酵罐中收集藻體細胞；從所述的藻體細胞中提取回收所述的富含多不飽和脂肪酸的油脂；其特征在于所述的培養為連續培養，連續培養過程包括如下工藝步驟: A、連續流加培養基質:培養基質泵入發酵罐，發酵液由出料泵經出料口泵出罐外； B、細胞的截留返回:步驟A中的發酵液進入封閉無菌的固液分離裝置進行細胞與發酵培養基分離，分離后的細胞濃縮液泵回發酵罐； C、發酵液的放流:當發酵罐內的細胞達到額定濃度時，將發酵罐內的部分培養基排出。
3.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟A是發酵過程中當發酵培養基中碳源濃度為5-20克/升時，開始將培養基質泵入發酵罐并維持罐內5-20克/升的碳源濃度。
4.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟A培養基質中碳源的添加比例高于其他營養物質，其他營養物質選自氮源，維生素，磷酸鹽，微量元素及其混合物。
5.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟B中細胞與發酵培養基的分離采用固液分離裝置。
6.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的步驟B中細胞濃縮液由發酵罐底部灌流回發酵罐內。
7.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的培養過程的溫度為20°C -35°C。
8.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的連續培養過程發酵培養基的溶解氧含量為5%-60%飽和度。
9.根據權利要求2所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻選用裂壺藻CGMCCN0.7693。
10.根據權利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的培養是將裂壺藻原始藻種經擴大培養后制成種子液，將種子液接種至發酵培養基進行培養。
11.根據權利要求1或9所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻活化傳代培養基采用如下組分組成: 葡萄糖10_30g/L，胰蛋白胨2-8g/L，酵母提取物l_5g/L，氯化鈉15_25g/L，硫酸鎂l-5g/L,磷酸二氫鉀 0.5-5g/L,氯化鉀 0.Ι-lg/L,氯化鈣 0.01-0.6g/L,硫酸銨 0.5_3g/L,碳酸氫鈉0.01-0.05g/L,乙二胺四乙酸二鈉鹽10-60mg/L,硼酸10-34.2mg/L,氯化錳0.01-lmg/L，三氯化鐵 0.5-3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅 0.Ι-lmg/L，氯化 3_[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑0.5-10mg/L，氯化鈷0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，余量為水，瓊脂 10g/L, pH=6_7。
12.根據權利要求10所述的富含DHA及DPA的油脂的制備方法，其特征在于所述的裂壺藻的擴培、發酵培養基、流加培養基質采用如下組分組成:葡萄糖40-60g/L，酵母提取物5-20g/L，氯化鈉10_20g/L，硫酸鎂l_5g/L，磷酸二氫鉀0.5-5g/L,氯化鉀0.Ι-lg/L,氯化鈣0.01-0.6g/L,硫酸銨0.5_3g/L，碳酸氫鈉.0.01-0.05g/L,氯化錳 0.01-lmg/L,三氯化鐵 0.5_3mg/L，氰鈷胺素 5_50mg/L，氯化鋅.0.1-lmg/L，氯化3-[ (4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5- (2-羥基乙基)-4-甲基噻唑 0.5-10mg/L,氯化鈷 0.01-0.lmg/L，硫酸銅 0.01-0.15mg/L，硼酸 10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二鈉鹽20-60mg/L，余量為水，pH=6-7。
13.根據權利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備普通食品添加劑中的應用。
14.根據權利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備特殊膳食食品添加劑中的應用。
15.根據權利要求1所述的富含DHA及DPA的油脂在制備藥品中的應用。
【文檔編號】A23L1/30GK103642860SQ201310683597
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】姜悅, 陳璇, 柳澤深 申請人:潤科生物工程（福建）有限公司