一種快速鑒別普通高溫放線菌的特異pcr方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速鑒別普通高溫放線菌的特異PCR方法，其技術方案是以樣品基因組DNA為模板，采用本發明設計的特異引物進行PCR反應，擴增普通高溫放線菌特征持家基因，實際擴增片段為733bp，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，鑒別樣品是否為普通高溫放線菌。本發明可快速識別普通高溫放線菌，只需DNA提取、PCR擴增和電泳檢測三步即可完成鑒別，具有高效、靈敏、便捷及成本低廉等顯著優點。
【專利說明】—種快速鑒別普通高溫放線菌的特異PCR方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學鑒別領域，具體涉及普通高溫放線菌的快速鑒別方法。
【背景技術】
[0002]普通高溫放線菌iThermoactinomycesvulgaris.、最早由 Tsiklinsky 于 1899年發現，是細菌域(Eubacteria)-厚壁菌門(Firmicutes)-芽孢桿菌綱(Bacilli)-芽孢桿菌目(Bacillales)-高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae) _高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)的典型種,常見于高溫堆肥等高溫環境中，嗜高溫,能產生豐富的菌絲和內生孢子。
[0003]普通高溫放線菌產酶十分豐富，可以產生耐熱的α -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、DNA聚合酶、羧肽酶T和幾丁質酶，在高溫環境中可分解淀粉、普魯蘭糖、環狀糊精、彈性蛋白、膠原蛋白、脂肪等底物，在淀粉深加工、皮革制造、高溫堆肥生產以及分子生物學等領域中有重要應用。近年來，在芝麻香型白酒釀造微生物研究中發現普通高溫放線菌為高溫大曲中的優勢菌種，其代謝產物對芝麻香型白酒特殊風味物質形成具有不可忽視的作用，因此，對高溫大曲等高溫環境中普通高溫放線菌菌株的篩選鑒別具有重要實踐意義。然而，普通高溫放線菌與其近緣種之間在形態學特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列方面均十分接近，應用常規技術鑒別繁瑣費時，無法滿足普通高溫放線菌的篩選及其應用研究的要求，因此，目前亟需建立一套準確、快速的普通高溫放線菌鑒別方法，為菌種的選育及其應用研究提供技術支撐。
[0004]
【發明內容】
[0005]本發明的目的是 提供一種可以快速鑒別普通高溫放線菌的方法。
[0006]為達到上述目的，本發明設計了普通高溫放線菌的特異PCR引物，進行特異PCR擴增反應，可擴增出普通高溫放線菌的特征持家基因，實際擴增片段為733bp。
[0007]用于鑒別普通高溫放線菌的引物序列如下:
上游引物 109F:5’ -GCGTGACGGGAAAATCTATC-3’
下游引物 801R:5’ -CATCACGGCTTTGTTAATAATC-3’。
[0008]本發明采用的技術方案如下:
1)獲取菌種基因組DNA；
2)采用上述引物在PCR儀上進行PCR擴增；
PCR 反應體系為 50 μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 μ?，引物(10 μ mol/L)各1.0 μ1，10 μ mol/L 的 dNTP 4.0 μ?，2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?，DNA 模板 1.0 μ?,-- H2O 37.4μ?。
[0009]PCR擴增的反應條件分別為:
109F/801R:95°C預變性 5 min，進入循環:94°C變性 30s，48。。復性 30s，72。。延伸 80s，共35個循環，然后72°C延伸lOmin。
[0010]3) PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。
[0011]4)普通高溫放線菌鑒別
在紫外燈下查看電泳條帶，在733bp處有電泳條帶的為普通高溫放線菌,在733bp處無條帶為其它種。
[0012]本發明經過充分的前期試驗篩選和優化，得到的引物特異性強，PCR擴增條件簡單，采用簡單PCR反應后，通過電泳檢測便可快速鑒別普通高溫放線菌，具有高效、便捷及成本低廉等顯著優點。
[0013]【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為普通高溫放線菌的特異性引物設計示意圖，其中有下劃線的部分為擴增片段對應的核苷酸序列，有下劃線的斜體加粗部分為所設計的引物特異性結合位點。
[0015]圖2為引物109R/801R的PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，1-T.vulgaris DSM 43016,2-T.vulgaris ACCC 41061,3-T.vulgaris ZM60,4_L.sacchari DSM43356，5-L.putidus DSM44608,6-B.thuringiensis CICC 22945,7-T.1ntermedius DSM43816,8-B.1icheniformis CICC 10101，9_L.tengchongensis CCTCC AA 208050,10-L.sediminis CCTCC AA 2011024,11-Blank, M-DL2000 marker?
[0016]具體實施案例
下面結合實施案例對本發明進行具體說明，實施案例是為了進一步闡述本發明，而不會給本發明造成任何限制。
[0017]實施例一:特異性 PCR引物的設計
根據GenBank上公開登錄的普通高溫放線菌基因序列信息進行引物 設計(見附圖1)。
[0018]參考序列的GenBank 登錄號為:AB242203 (Thermoactinomyces vulgaris, gyrBgene, complete cds, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB242203.1)。
[0019]在89-109 處設計上游引物，命名為 109F。序列為:5’ -GCGTGACGGGAAAATCTATC-3’。
[0020]在800-822處設計下游引物，命名為80IR。 序列為:5’-CATCACGGCTTTGTTAATAATC-3’ 。
[0021 ] 實施例二:引物特異性驗證
1.1普通高溫放線菌菌株及其近緣種菌株
普通高溫放線菌(Thermoac tinomyces vulgaris DSM 43016 ),中間型高溫放線菌(Thermoactinomyces intermedius DSM 43816),H 1? |if iLaceyella sacchari
DSM 43356)，惡臭萊西氏菌putidus DSM44608)購自德國微生物菌種保藏中心；蘇云金芽抱桿菌Cfeci77w5.thuringiensis CICC 22945),地衣芽抱桿菌licheniformis CICC 10101)來自中國工業微生物菌種保藏管理中心-,Laceyellatengchongensis CCTCC AA 2^^,Laceyella sediminis CCTCC AA 2011024 購自中國典型培養物保藏中心；普通高溫放線菌vulgaris ACCC 41061)購自中國農業微生物菌種保藏管理中心；普通高溫放線菌vulgaris ZM60)由CICC自行分離鑒定。
[0022]I.2菌株基因組DNA提取
采用天根生化科技(北京)有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒對菌株的基因組DNA進彳了提取。
[0023]1.3基因組DNA的PCR擴增
PCR 反應體系為 50 μ?，其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 μ?，引物(10 μ mol/L)各1.0 μ1，10 μ mol/L 的 dNTP 4.0 μ?，2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?，DNA 模板 1.0 μ?,-- H2O 37.4μ?。
[0024]PCR擴增的反應條件分別為:
95°C預變性5 min，進入循環:94°C變性30s，48°C復性30s，72。。延伸80s，共35個循環，然后72°C延伸lOmin。
[0025]1.4 PCR產物檢測
PCR擴增產物分別在1%瓊脂糖凝膠中電泳，在733bp處有電泳條帶的菌株為普通高溫放線菌，在733bp處無條帶為其它`種(詳見附圖2)。
【權利要求】
1.一種普通高溫放線菌的快速鑒別方法，其特征在于:經過簡單的PCR反應，可以快速鑒別普通高溫放線菌。
2.按照權利要求1所述的普通高溫放線菌快速鑒別方法，其特征在于:用于鑒別普通高溫放線菌的特異引物為:
上游引物 109F:5’ -GCGTGACGGGAAAATCTATC-3’
下游引物 801R:5’ -CATCACGGCTTTGTTAATAATC-3’。
3.按照權利要求2所述的普通高溫放線菌快速鑒別方法，其特征在于:PCR反應體系為50 μ?,其中 IOXTaq reaction buffer 5.0 KL,引物(10 μ mol/L)各 1.0 M-1,10 μ mol/L的 dNTP 4.0 μ?, 2.5U 的 Taq 酶 0.6 μ?, DNA 模板 1.0 μ?, dd H2O 37.4 μ?。
4.按照權利要求3所述的普通高溫放線菌種快速鑒別方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件分別為:95°C預變性5 min，進入循環:94°C變性30s，48°C復性30s，72°C延伸80s，共35個循環，然后72°C延伸IOmin0
5.按照權利要求4所述的普通高溫放線菌快速鑒別方法，其特征在于:PCR擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。
6.按照權利要求5所述的普通高溫放線菌快速鑒別方法，其特征在于:在733bp處有電泳條帶的菌株為普通高溫放 線菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614487SQ201310678186
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月14日 優先權日:2013年12月14日
【發明者】程池, 趙紀文, 姚粟, 信春暉, 李輝, 劉勇, 張明娟 申請人:中國食品發酵工業研究院, 山東扳倒井股份有限公司