一種改善植物性狀的方法
【專利摘要】本發明涉及一種改善植物性狀的方法，將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因轉入植物中。本發明的方法可極好地應用于植物品種的改良，為運用轉基因等分子育種技術培育植物新品種提供了非常有價值的基因資源。
【專利說明】一種改善植物性狀的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程和植物學領域，更特別地，本發明涉及一種改善植物性狀的方法。
【背景技術】
[0002]植物是人類社會食物和和生活生產資料的重要來源，幾乎所有的人類食物都直接或間接的來源于植物。隨著世界人口的增長，對糧食的需求量在不停增加，提高植物尤其是農作物的產量是人類社會發展的關鍵。更高的植物產量意味著在相同的耕地面積下收獲更多的糧食，水果或者木材，為人類社會的發展提供強大的支持。傳統的農作物育種方式包括雜交育種，誘變育種等，這些技術的特點相對來說進展緩慢，定向改造性不強，且耗費時間極長。利用基因工程技術和轉基因技術提高植物產量日漸成為現今人們改造植物尤其是農作物的主要手段。基因工程技術和轉基因技術的主要特點是定向改造，改造的時間周期大大縮短，且能夠在已有的優良品種基礎上特異的增加所需的植物性狀，例如增加產量，抵抗包括聞鹽等不良環境，抗病蟲害等。
[0003]在當今世界森林資源日益匱乏的環境下，林木育種已成為高效、優質實現林業生產任務的重要措施之一。林木的特點是生長發育周期長，遺傳雜合性高，個體占據空間大，性狀在幼年和成年期變化大等，這些特性對于林木育種的進展都有很大影響。
[0004]傳統的林木育種有樹種、種源和優樹選擇，雜交育種及倍性育種等方式，選育一個世代的時間由十幾年到幾十年不等，非常漫長。利用生物技術手段可以顯著縮短育種時間，林木遺傳轉化技術的日臻成熟也為利用基因工程培育林木新品種提供了基礎。但是，由于生物技術育種研究工作開展時間不長，林木遺傳轉化技術相對不夠成熟，真正能夠應用于林木育種的基因還很有限，這都限制了林木基因工程育種的發展。因此，在進一步完善遺傳轉化技術、開發新的功能基因的同時·，充分挖掘已知功能基因的新功能和應用價值也是培育林木新品種的一個快速有效的手段。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種改善植物性狀的方法。
[0006]本發明還有另一目的在于提供一種提高植物抗鹽能力的方法。
[0007]在本發明的第一方面，提供一種改善木本植物性狀的方法，包括:將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入木本植物中。
[0008]在一個優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于草本植物。
[0009]在另一優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714F。
[0010]在另一優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于禾本科。[0011]在另一優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于水稻屬或玉米屬。
[0012]在另一優選例中，所述的CYP714D1基因是:
[0013](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 30的基因；
[0014](b)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因；
[0015](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因；或
[0016](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸。
[0017]在另一優選例中，所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥)，十字花科植物(如擬南芥)，茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0018]在另一優選例中，所述的草本植物是禾本科稻屬的植物。
[0019]在另一優選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物，桑科植物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物。
[0020]在另一優選例中，所述的木本植物是楊柳科植物、桑科植物、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0021]在另一優選例中，在木本植物中表達外源的來源于草本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體，從而下調木本植物中細胞色素P450家族714亞家族的基因的表達。
[0022]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0023](I)將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述基因的植物細胞、組織、器官或種子；和
[0024](2)將步驟⑴獲得的轉入了所述基因的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0025]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0026](Si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體；
[0027](s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物。
[0028]在另一優選例中，所述的方法還包括:(S3)選擇出轉入了外源的細胞色素P450家族714亞家族基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0029]在另一優選例中，所述的方法中，所述的改善木本植物性狀包括:
[0030]增加株高；
[0031]增加生物量；
[0032]增加果實產量；
[0033]增加果實數量；
[0034]增加花朵數量；
[0035]促進生長；
[0036]增加莖的直徑、節間長度、葉片面積或葉柄長度；或[0037]提高內源GA或/和IAA的含量。
[0038]在本發明的另一方面，提供來源于草本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途，用于改善木本植物性狀。
[0039]在一個優選例中，所述的來源于草本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714F。
[0040]在本發明的另一方面，提供一種改善草本植物性狀的方法，包括:將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入草本植物中。
[0041]在一個優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于木本植物。
[0042]在一個優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于楊柳科。
[0043]在另一優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0044]在另一優選例中，所述的細胞色素P450家族714亞家族基因是:
[0045](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:31的基因；
[0046](b)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因；
[0047](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因；或
[0048](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸。
[0049]在另一優選例中，所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥)，十字花科植物(如擬南芥)，茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0050]在另一優選例中，所述的草本植物是茄科茄屬的植物。
[0051]在另一優選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物，桑科植物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物。
[0052]在另一優選例中，所述的木本植物是楊柳科植物、桑科植物、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0053]在另一優選例中，在草本植物中表達外源的來源于木本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體，從而下調草本植物中細胞色素P450家族714亞家族的基因的表達。
[0054]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0055](I)將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述基因的植物細胞、組織、器官或種子；和
[0056](2)將步驟(1)獲得的轉入了所述基因的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0057]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0058](Si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體；
[0059](s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物。[0060]在另一優選例中，所述的方法還包括:(s3)選擇出轉入了外源的細胞色素P450家族714亞家族基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0061]在另一優選例中，所述的方法中，所述的改善草本植物性狀包括:
[0062]增加株高；
[0063]增加生物量；
[0064]增加果實產量；
[0065]增加果實數量；
[0066]增加花朵數量；
[0067]促進生長；
[0068]增加莖的直徑、節間長度、葉片面積或葉柄長度；或
[0069]提高內源GA或/和IAA的含量。
[0070]在本發明的另一方面，提供來源于木本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途，用于改善草本植物性狀。
[0071]在一個優選例中 ，所述的來源于木本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0072]在本發明的另一方面，提供一種提高植物抗鹽能力的方法，包括:將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物中。
[0073]在一個優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因來源于木本植物，被轉入的植物來源于草本植物。
[0074]在另一優選例中，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0075]在另一優選例中，所述的CYP714A3基因是:
[0076](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:31的基因；
[0077](b)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因；
[0078](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因；或
[0079](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸。
[0080]在另一優選例中，所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥)，十字花科植物(如擬南芥)，茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0081]在另一優選例中，所述的草本植物是禾本科稻屬的植物。
[0082]在另一優選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物，桑科植物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物。
[0083]在另一優選例中，所述的木本植物是楊柳科植物、桑科植物、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0084]在另一優選例中，所述的木本植物是楊柳科楊樹屬的植物。
[0085]在另一優選例中，在草本植物中表達外源的來源于木本植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體，從而下調草本植物中細胞色素P450家族714亞家族的基因的表達。[0086]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0087](I)將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述基因的植物細胞、組織、器官或種子；和
[0088](2)將步驟(1)獲得的轉入了所述基因的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0089]在另一優選例中，所述的方法包括:
[0090](Si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體；
[0091](s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物。
[0092]在另一優選例中，所述的方法還包括:(S3)選擇出轉入了外源的細胞色素P450家族714亞家族基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0093]在本發明的另一方面，提供細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途，用于提高植物抗鹽能力。
[0094]在一個優選例中，所述的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0095]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0096]圖1、轉化載體及轉基因鑒定。A，植物表達載體結構圖；B，轉基因楊樹的PCR鑒定；C，轉基因楊樹的RT-PCR分析；D，轉基因楊樹的⑶S染色分析。
[0097]圖2、轉基因楊樹表型。A，株高表型；B，根；C，節間和莖粗；D，葉片和葉柄；E，Southern blot 分析。
[0098]圖3、生長曲線和生物量。A，生長曲線；B，葉片數量；C，莖的直徑；D，節間和葉柄長
度；E，鮮重；F，干重。
[0099]圖4、莖的顯微觀察。A-C，莖橫切面；D_F，木質部；G_I，韌皮部纖維；J_L，莖外皮縱切面。
[0100]圖5、莖的顯微測量。A，總長度(T)、木質部(X)、形成層(Ca)、韌皮部(P)、外皮(OB) ;B，木質部細胞數量；C，木纖維長度；D，木質部纖維(Xf)和韌皮部纖維(Pf)細胞壁厚度；E，皮層細胞縱長，Ep，表皮，Co，周皮，Pa，皮下組織。
[0101]圖6、轉基因楊樹與野生型內源GA和IAA的含量測定。
[0102]圖7、野生型與轉基因楊樹中GA途徑相關基因的表達量分析。
[0103]圖8、野生型與轉基因楊樹中PtCYP714基因家族成員的表達量分析。
[0104]圖9、ZmCYP714轉基因楊樹的表型，WT為野生型楊樹，L1-L3為轉基因楊樹。
[0105]圖10、PtCYP714A3轉基因番茄的PCR鑒定。M:DNA分子量Marker ；P:質粒正對照；N:負對照；WT:野生型番茄；L2-L14:不同的轉基因番茄株系。
[0106]圖11、PtCYP714A3轉基因番茄的RT-PCR鑒定。WT:野生型番茄；L2_L14:不同的轉基因番爺株系。
[0107]圖12、楊樹PtCYP714A3基因在MicroTom番茄品種中異源表達提高了轉基因番茄的株高和生物量。WT:野生型番茄；L3，L5，Lll和L14:不同的轉基因番茄株系。
[0108]圖13、楊樹PtCYP714A3基因在PKM番茄品種中異源表達提高了轉基因番茄的株高。PKM:野生型番茄；L53:轉基因番茄。
[0109]圖14、轉基因水稻的PCR和RT-PCR鑒定。
[0110]M，DNA分子量Marker ;P，質粒正對照；N，負對照；WT，野生型水稻；2_38，不同的轉基因株系。
[0111]圖15、NaCl(150mM)處理。WT，野生型水稻；Z33和Z38，兩個轉基因水稻株系。
[0112]圖16、NaCl(150mM)處理12天后野生型和轉基因水稻的存活率。
【具體實施方式】
[0113]本發明人經過廣泛的研究，找到一種對于改善植物性狀有用的方法，通過將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因轉入植物中，進而促進植物生長，同時使得植物抗鹽能力增強。本發明的方法可極好地應用于植物品種的改良，為運用轉基因等分子育種技術培育木本植物新品種提供了非常有價值的基因資源。
[0114]本發明中，所述的“草本植物”是一類植物的總稱，其植物體木質部較不發達至不發達，莖多汁，較柔軟；且，所述的“草本植物”天然基因組中含有細胞色素P450家族714亞家族(CYP714)家族的基因。例如，所述的“草本植物”可以是:禾本科(Gramineae)，露3?樹科(Pandanaceae),黑三棱科(Sparganiaceae),水蕹科(Aponogetonaceae),眼子菜科(Potamogetonacea·e)，茨藻科(Najadaceae,冰沼草科(Scheuchzeriaceae),澤 ?寫科(Alismataceae)花菌科(Butomaceae),水瞥科(Hydrocharitaceae),霉草科(Triuridaceae)，莎草科(Cyperaceae)，掠桐科(模柳科)(Palmae(Arecaceae)),天南星科(Araceae),浮萍科(Lemnaceae),須葉藤科(Flagellariaceae),帚燈草科(Restionaceae)，刺鱗草科(Centrolepidaceae)，黃眼草科(Xyridaceae)，谷精草科(Eriocaulaceae)，鳳梨科(Bromeliaceae),鴨妬草科(Co_elinaceae),雨久花科(Pontederiaceae),田蔥科(Philydraceae),燈心草科(Juncaceae),百部科(Stemonaceae)，百合科(Liliaceae)，石蒜科(Amaryllidaceae),菌葡薯科(箭根薯科)(Taccaceae)，暮葡科(Dioscoreaceae)，鸞尾科(Iridaceae)，色蓮科(Musaceae),姜科(Zingiberaceae),美人蓮科(annaceae)，竹芋科(Marantaceae),水玉替科(Burmanniaceae)或蘭科的植物。
[0115]作為本發明的優選方式，所述的草本植物是:禾本科植物，例如禾本科稻屬的水稻，十字花科植物；以及茄科植物，例如茄科茄屬的番茄。所述的禾本科植物包括但不限于:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等；所述的茄科植物包括但不限于:番茄，顛茄等；或所述的十字花科植物包括但不限于:擬南芥。
[0116]本發明中，所述的林木是指“木本植物”，指根和莖因增粗生長形成大量的木質部、而細胞壁也多數木質化的堅固的植物；且所述的木本植物天然基因組中含有CYP714家族的基因。例如，所述的“木本植物”可以是:楊柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、銀杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、蘇鐵科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛莫科(Ranunculaceae)、懸鈴木科(Platanaceae)、偷科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、樣科(Betulaceae)、稱猴桃科(Actinidiaceae)、錦奏科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、鍛樹科(Tiliaceae)、徑柳科(Tamaricaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、蘇木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石槽科(Punicaceae)、拱桐科(Nyssaceae)、山萊英科(Cornaceae)、八角柄科(Alangiaceae)、衛矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黃楊科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盤木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)，撤攬科(Burseraceae)、結梗科(Campanulaceae)、紅樹科(Rhizophoraceae)、植香科(Santalaceae)、木庫科(Oleaceae)或玄參科(Scrophulariaceae)的植物。
[0117]作為本發明的優選方式，所述的木本植物是指楊柳科(如楊屬，更特別如楊樹)或桑科(如構樹屬，更特別如光葉楮)、桃金娘科(如桉屬，更特別如桉樹)的木本植物。
[0118]草本植物和木本植物最顯著的區別在于它們莖的結構，草本植物的莖為“草質莖”，莖中密布很多相對細小的維管束，充斥維管束之間的是大量的薄壁細胞，在莖的最外層是堅韌的機械組織。草本植物的維管束也與木本植物不同，維管束中的木質部分布在外側而韌皮部則分布在內側，這是與木本植物完全相反的，另外草本植物的維管束不具有形成層，不能不斷生長，因而樹會逐年變粗而草和竹子就沒有這樣的本領。
[0119]細胞色素P450家族(CYP450)基因是古老的超基因家族，對P450的分類和命名是根據基因編碼的氨基酸序列的相似性進行的。如果一個新發現的P450基因的氨基酸序列與其他已知的P450氨基酸序列相同性大于40%,則它們屬于同一個家族；如果兩個P450的氨基酸序列相同性大于40%而小于55%,則它們分屬于同一個家族的兩個不同亞家族；如果兩個P450的氨基酸序列相同性大于55%,則它們屬于同一個亞家族。本發明中所述的“細胞色素P450家族714亞家族”，或“CYP714亞家族”，或“P450家族714亞家族”，或“CYP714家族”，是指與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:30或SEQ ID NO:31所編碼的多肽的氨基酸序列相同性大于40% 的基因，優選大于55%的基因，例如:CYP714D、CYP714A、CYP714E，CYP714FCYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0120]在水稻中目前發現的CYP714家族只有714D1 —個成員，在楊樹中通過序列比對發現的 CYP714 家族包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1 共6 個成員。(The P450Homepage, http://drnelson.uthsc.edu)
[0121]本發明中，“轉基因”，系指通過任何方法導入植物個體一段外源的雙鏈脫氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游離在染色體外，也可以整合到受體植物染色體的基因組上；可以通過生殖過程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴增的。
[0122]本發明中，除非另外說明，所述的“外源基因”也稱為“異源基因”是指與待轉基因的植株本身不同種植物來源的基因。例如，相對于茄科的植物，來源于楊柳科的基因為外源基因。
[0123]本發明人發現，CYP714基因家族成員所編碼的蛋白具有降解赤霉素的作用，而赤霉素是一種雙萜類化合物的植物激素，其廣泛存在于植物中，可發揮促進植物營養生長等作用。下調CYP714基因家族成員的表達或活性可以有效地減少赤霉素受降解的比例，使得植物中赤霉素保留較高的含量，有利于林木的生長。
[0124]進一步地，本發明人還發現，外源的細胞色素P450家族714亞家族基因，在轉入木本植物中后，可有效地改善木本植物的性狀，同時木本植物來源的細胞色素P450家族714亞家族基因，在轉入草本植物中后，也可有效地改善草本植物的性狀。
[0125]現有技術中，一些草本植物(如水稻)來源的CYP714家族基因已知是一個降解赤霉素的基因，然而，本發明人在深入研究后意外地發現，外源的CYP714家族基因在轉化木本植物中后，并非發揮降解赤霉素的功能，反而可以顯著下調木本植物自身CYP714家族的基因的表達，使得相應轉基因的木本植物中的赤霉素含量和IAA含量升高，從而使得木本植物生物量增加，生長速度顯著增加。發明人同時還發現，木本植物來源的CYP714家族基因在轉化草本植物中后，也同樣使得相應轉基因的草本植物中的赤霉素含量和IAA含量升高，從而使得草本植物生物量增加，經濟作物的果實數量和總果實產量增加，植株增高，生長速度顯著增加。
[0126]本發明還涉及上述水稻來源的CYP714基因的變異體(變體)和上述楊樹來源的CYP714基因的變異體(變體)。所述的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
[0127]本發明還涉及與上述的水稻或楊樹來源的CYP714基因雜交且兩個序列之間具有至少70%，更佳地至少80%，更佳地至少85%，更佳地至少90%，更佳地至少95%，更佳地至少98%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指:(I)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。
[0128]因此，作為本發明的一種優選方式，采用草本植物來源的CYP714D1基因來用于轉化木本植物。作為本發明的另一種優選方式，采用木本植物來源的CYP714A3基因來用于轉化草本植物。 編碼的蛋白與相應草本植物來源的CYP714D1基因具有相同功能的CYP714D1的同源基因或類似物或變異體，以及編碼的蛋白與相應木本植物來源的CYP714A3基因具有相同功能的CYP714A3的同源基因或類似物或變異體也可被應用于本發明的方法。
[0129]本發明提供了一種改善植物性狀的方法，該方法包括將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因轉入植物中，從而使得所述木本植物發生以下一種或幾種性狀的改變:增加株高；增加生物量；增加果實產量；增加果實數量；增加花朵數量；促進生長；增加莖的直徑、節間長度、葉片面積或葉柄長度；提高內源GA或/和IAA的含量；或提高對鹽的耐受能力。
[0130]使一種種屬來源的植物表達另一種種屬來源的基因，例如使木本植物中表達草本植物來源的基因或使草本植物中表達木本植物來源的基因的方法是本領域周知的。一般可通過轉入一種植物來源的細胞色素P450家族714亞家族基因的表達構建物使另一種植物過表達細胞色素P450家族714亞家族基因。
[0131]作為本發明的一種優選方式，獲得轉基因植株的方法如下:[0132](I)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有A植物來源的細胞色素P450家族714亞家族基因；
[0133](2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使該A植物來源的細胞色素P450家族714亞家族基因轉入B植物細胞，并且整合到B植物細胞的染色體上；
[0134](3)選擇出轉入所述A植物來源的細胞色素P450家族714亞家族基因的木本植物細胞或組織；和
[0135](4)將步驟(3)中的B植物的細胞或組織再生成完整植物。
[0136]其中，可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。
[0137]此外，還可以應用一些特異性的啟動子，如組織表達特異性啟動子，來可控地使轉入的細胞色素P450家族714亞家族基因(A植物來源的基因)被表達于被轉入基因的植物(B植物)的特定部位，從而改造B植物的株型。
[0138]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0139]實施例1、轉基因楊樹的建立
[0140]水稻來源的0sCYP714Dl基因序列如下(SEQ ID NO:1):
【權利要求】
1.一種改善植物性狀的方法，其特征在于，包括:將來源于A植物的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入B植物中，從而改善B植物的性狀，并且所述的A植物與B植物分別屬于植物分類學上兩個不同的科。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的B植物為木本植物，并且所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括但不限于:CYP714D、CYP714A、CYP714E，CYP714F，CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A植物為木本植物，B植物為草本植物，并且所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括但不限于:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的草本植物包括但不限于:禾本科植物，十字花科植物，茄科植物，豆科植物，薔薇科植物和蝶形花科植物；所述木本植物包括但不限于:楊柳科植物，桑科植物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改善植物性狀包括: 增加株高； 增加生物量； 增加果實產量； 增加果實數量；` 增加花朵數量； 促進生長； 增加莖的直徑、節間長度、葉片面積或葉柄長度； 提高內源GA或/和IAA的含量。
6.一種提高植物抗鹽能力的方法，其特征在于，包括:將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物中。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的外源的細胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714FCYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物包括但不限于:禾本科植物，十字花科植物，茄科植物，豆科植物，楊柳科植物，桑科植物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，樺科植物，懸鈴木科，錦葵科植物，椴樹科植物，梧桐科植物，薔薇科植物，蝶形花科植物，黃楊科植物，漆樹科植物。
9.如權利要求1或6所述的方法，其特征在于，包括: (1)將外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述基因的植物細胞、組織、器官或種子；和 (2)將步驟(1)獲得的轉入了所述基因的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，包括: (Si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有外源的細胞色素P450家族714亞家族基因或其變體；(s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使外源的細胞色素P450家族714亞家族基因`或其變體轉入植物。
【文檔編號】C12N15/53GK103865939SQ201310676182
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2012年12月11日
【發明者】張洪霞, 王翠亭 申請人:中國科學院上海生命科學研究院