一種溶藻弧菌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種溶藻弧菌的檢測試劑盒，具體包括引物及LAMP實際反應液，本發明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低，操作簡便。
【專利說明】一種溶藻弧菌檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于病原菌診斷【技術領域】，具體涉及一種應用LAMP技術檢測溶藻弧菌的快速檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002]溶藻弧菌是一種革蘭氏陰性條件致病菌，通常人類感染是因為生食海鮮或者傷口接觸了帶菌的海水或海產品。臨床癥狀主要表現為傷口感染、胃腸炎、中耳炎、眼內炎、食物中毒和敗血癥等疾病。目前海洋病原菌檢測的傳統方法主要包括前增菌、選擇性增菌、選擇性培養、生化鑒定、血清學鑒定，需5~6天出報告，方法繁瑣，費時費力。而PCR方法，雖然快速、敏感、特異，但對操作人員要求較高、且需特殊儀器，同樣不適合現場檢測。
[0003]環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplif1-cation, LAMP)技術是Notomi等2000年發明的一種新穎的擴增技術，該技術在具有置換活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase)作用下，利用特別設計的四段引物識別靶基因的六個區域，恒溫條件下進行核酸擴增，以達到對目的基因的高效、特異復制的目的。另外通過環引物的添加，大大加快了反應的速度，整個過程只需要I~2 h。其結果可以根據反應的副產物白色沉淀焦磷酸鎂來判斷是否發生擴增，也可以在反應管中加入熒光染料，反應后觀察是否變色來進行鑒別。該檢測技術較常規PCR和real-time PCR來說不需要昂貴的設備、特殊的實驗室環境和專業技術人員。其突出優點有:操作簡便，耗時少，且特異性好、靈敏度高。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種利用LAMP技術對溶藻弧菌進行快速檢測的試劑盒。`
[0005]本發明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
溶藻弧菌快速檢測試劑盒(LAMP法)，它包括:
(I)6條引物:
表1溶藻弧菌引物
【權利要求】
1.一種溶藻弧菌檢測試劑盒，其特征在于，包括: 引物； 2*反應緩沖液； Chelex-1OO 試劑； Bst DNA聚合酶； 鈣黃綠素； 陽性對照DNA ； 陰性對照DNA ； 所述的引物為6條，分別為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的外側引物F3和如SEQID N0.2所示的核苷酸序列的外側引物B3^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的內側引物FIP和如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的內側引物BIP^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的環引物LF和如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列環引物LB ； 所述的2*反應的組成及含量為: pH8.8 Tris-HCl 40 mM KCl20 mM MgSO416 mM (NH4)2SO420 mM Tween200.2 % Betaine1.6 M dNTPs1.4 mM MnCl2I mM。
2.根據權利要求1所述的溶藻弧菌快速檢測試劑盒，其特征在于，包括以下檢測步驟: 1)取各引物干粉，加去離子水配置成IOOuM保存液，實驗時將引物保存液稀釋十倍使用，向Chelex-1OO中加入20ml去離子水，配成5% ChelexlOO溶液； 2)細菌基因組DNA的提取:取Iml樣品菌液離心棄上清，取沉淀，細菌沉淀中加入Iml5% ChelexlOO溶液，震蕩混勻后置100°C水浴lOmin，然后立即冰浴lmin，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清即為樣本DNA ； 3)在冰盒上配置25μ I反應體系如下: 2*反應緩沖液IOuM12.5μ I F3 溶液 IOuM1.Ομ I Β3 溶液 IOuM1.Ομ I FIP 溶液 IOuM1.Ομ I BIP 溶液 IOuM1.0μ I LF 溶液 IOuM1.0μ I LB 溶液 IOuM1.0μ I Bst DNA 聚合酶 8u/ul1.0μ I 鈣黃綠素50uM1.0μ I 樣本 DNA2.0μ I 去尚子水2.5 μ I4)擴增:將配置好的反應溶液置于恒溫金屬加熱儀中，在63°C的條件下反應40分鐘，在80°C條件下恒溫 5分鐘使酶滅活以終止反應；若反應管變為草綠色即可判定含有溶藻弧菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614486SQ201310673719
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】胡成進, 劉曉斐, 湯潛 申請人:胡成進