檢測阿茲海默癥的方法及阿茲海默癥基因檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測阿茲海默癥的方法及阿茲海默癥基因檢測裝置，所述裝置包含一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一第一SNP檢測區，其中第一SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，其中第一、第二檢測線分別固定不同的APOE等位基因的核苷酸探針，而第一與第二檢測線的探針存有一核苷酸的差異。本發明藉由將多個涵蓋APOE等位基因的單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)位點的探針并配合預定的側向流方向配置于薄膜墊上形成所述的第一檢測線以及第二檢測線，達到有效且專一于單一步驟中測定APOE基因型的目的，以作為阿茲海默癥的預防與治療的依據。
【專利說明】檢測阿茲海默癥的方法及阿茲海默癥基因檢測裝置
【技術領域】
[0001]本發明是關于一種快速篩檢基因的裝置，尤指配置有適當檢測部件而可供用于快速且精確的篩檢阿茲海默癥的檢測試片。本發明亦關于一種檢測方法，尤指利用篩檢基因的裝置檢測阿茲海默癥的方法。
【背景技術】
[0002]阿茲海默癥初期最常見的癥狀是難以記住最近發生的事，隨著疾病進展，癥狀將會包括譫妄、易怒、具攻擊性、情緒起伏不定、喪失長期記憶等。病患通常因為無法發揮正常功能，而退出家庭和社會的社交關系，并隨著身體功能逐漸喪失，終致死亡。初步懷疑罹患阿茲海默癥時，通常藉由行為評估以及認知測試(Cognitive test)來確認診斷，進階的診斷為神經影像檢查輔助診斷。
[0003]阿茲海默癥的癥狀可分為早期、中期以及晚期，各時期反應在行為與認知能力損害程度有所不同。此外，依據發作的時間早晚又分為主要發生于65歲以前的早發型與發生于65歲以后的晚發型阿茲海默癥，其中10%的患者屬于早發型阿茲海默癥，與家族病史強烈相關；而90%的患者屬于晚發型阿茲海默癥，與家族病史較無直接關系。早發型阿茲海默癥可分為第一型阿茲海默癥(Alzheimer disease typel, ADI)、第三型阿茲海默癥(Alzheimer disease type3, AD3)以及第四型阿茲海默癥(Alzheimer diseasetype4, AD4),晚發型阿茲海默癥即第二型阿茲海默癥(Alzheimer disease type2, AD2)。就兩者的變異類型而言，相較于早發型阿茲海默癥通常為APP、PSENl、PSEN2基因突變所造成，晚發型阿茲海默癥通常與單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)相關，例如與脂蛋白E(A p0lip0pix)tein E, ΑΡ0Ε)的單核苷酸多態性有高度相關性，例如AP0E-rs7412 以及 AP0E_rs429358。
[0004]請配合參考圖5所示，研究顯示與晚發型阿茲海默癥相關的基因型可依據SNP分為 ApoE ε 2、ApoE ε 3、ApoE ε 4，如圖 5 所示，ApoE ε 2 是指 SNP rs429358 與 rs7412 皆為胸苷(thymidine, T)，注記為E2型，為保護性基因型；ApoE ε 3是指SNP rs429358與rs7412分別為T與胞苷(cytidine，C)，注記為E3型，為低風險性基因型；ΑροΕ ε 4是指SNPrs429358與rs7412皆C，注記為E4型，為高風險性基因型。具有所述的保護性基因型、低風險性基因型與高風險性基因型的攜帶者(carrier)罹患阿茲海默癥的風險依序由低至高。研究人員發現APOE等位基因皆為高風險性基因型的個體，注記為E4/E4，確實較為容易罹患晚發型阿茲海默癥；相對的，APOE等位基因皆為保護性基因型的個體，注記為E2/E2，摧患晚發型阿茲海默癥的風險相對最低(Influence of apolipoprotein E genotype onthe transmiss1n of Alzheimer disease in a community-based sample.G.Jarvikj E.B.Larson, K.Goddard, G.D.Schellenbergj Ε.M.Wi jsman.Am J Hum Genet.1996January; 58 (I):191 - 200)。
[0005]為了檢測不同個體或者不同細胞的基因表達(gene express1n)或者等位基因型(allele genotype),過去已經發展出多種檢測基因的方法,其中北方墨點(NorthernBlot)分析或者南方墨點(Southern blot)分析,其原理為令經標定的特定核苷酸探針(nucleotide probe)與經電泳分離、轉染而得的含有標的RNA或DNA的薄膜進行雜交反應(hybridizat1n),進而通過經標定的探針的訊號以偵測目標RNA或DNA存在。此外,聚合酶鏈式反應配合定序分析，鑒定等位基因型亦為常見手段，但由于此類方法操作上的限制，并不利于使用者在家自行篩檢，必須自始至終于專業的實驗室經由特定的儀器進行反應。一般而言，對于一般APOE基因的SNP的檢測，仍必須通過核酸分離與定序的程序予以確認。
[0006]中國臺灣第1352738號專利案提供一種偵測阿茲海默癥的方法，其是針對ABCA2基因的rs908832變異基因的次要等位基因型進行檢測，而可供用于測定白種人族群個體罹患早發型阿茲海默癥的風險。該專利案并未提供檢測晚發型阿茲海默癥的技術，且此檢測方法必須先萃取病人的DNA并經繁復的步驟以分別鑒定ABCA2等位基因的各種基因型，且并未提供利用側向流分析核苷酸樣品的檢測裝置，無法于一步驟試驗中辨別特定基因的等位基因型。該專利案無法解決現有技術仍需要自始至終于專業實驗室經由特定的儀器進行反應而需繁瑣步驟進行檢測的缺點。
[0007]基于上述可知，現有技術缺乏一種快速篩檢阿茲海默癥的檢測方法與裝置，并藉由篩檢的結果以幫助個體預防或治療阿茲海默癥。
【發明內容】
[0008]有鑒于現有技術仍需多步驟純化檢體、制備樣品、分析樣品，藉以確認阿茲海默癥相關基因的單核苷酸多態性基因型(single nucleotide polymorphism genotyping),本發明的目的在于解決現有技術需要重復進行不同等位基因的SNP分析的問題，提供一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其可同時針對APOE等位基因的單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorph ism, SNP)位點進行偵測，達到有效且專一的測定APOE基因型的目的。此外，現有技術缺乏針對晚發型阿茲海默癥的快速篩檢方法，故本發明亦提供針對晚發型阿茲海默癥的檢測技術。
[0009]因此，一方面，本發明提供了一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其包含一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結合墊、薄膜墊依序排列設置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設有一第一 SNP檢測區以及一控制線，其中第一 SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，第一檢測線、第二檢測線各自具有一 APOE等位基因的核苷酸探針，前述第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針彼此之間具有一核苷酸差異。
[0010]另一方面，本發明亦提供一種檢測阿茲海默癥的方法，其包含:
[0011]提供一阿茲海默癥基因檢測裝置，其包括一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結合墊、薄膜墊依序排列設置于基板的一表面上并且彼此相互連接；其中結合墊具有一標定物；薄膜墊設有一第一 SNP檢測區以及一控制線，其中第一SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，第一檢測線、第二檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，且第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異；
[0012]將一含有經標定的APOE基因片段的溶液施用于樣品墊，使該經標定的APOE基因片段朝向結合墊移動，經標定的APOE基因片段與標定物結合形成一復合物，繼而朝向薄膜墊移動，所述的復合物與第一 SNP檢測區的第一檢測線和/或第二檢測線結合而產生訊號；以及
[0013]依據該第一檢測線和/或第二檢測線產生訊號，判斷該APOE基因片段的基因型。
[0014]進一步的，所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，薄膜墊還設有一第二 SNP檢測區，第二 SNP檢測區包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第三檢測線以及第四檢測線具有不同的APOE等位基因的核苷酸探針，所述的第二 SNP檢測區是用以偵測與第一 SNP檢測區不同的SNP位點，其中第三檢測線以及第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針與第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針所涵蓋的APOE的SNP位點不同。
[0015]本發明的阿茲海默癥基因檢測裝置于使用時，將樣品溶液施用于樣品墊上，令樣品溶液的標的核酸分子通過側向流(lateral flow)朝向吸附墊方向移動,標的核酸分子通過結合墊而與結合墊內的標定物結合后，繼而進入薄膜墊，而與所述檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針專一性的結合，依據偵測第一檢測區、第二檢測區的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線的訊號可以判定標的核酸分子的APOE等位基因型，而再加以定序，依據本發明的手段可以直接簡化現有技術的檢測流程，于一步驟中即可測定待測對象的APOE的多種等位基因型。
[0016]依據本發明，所述的樣品溶液是由一待測對象的核酸檢體所制備而得，其含有經標定的APOE基因片段的溶液；較佳的，樣品溶液中含有待測對象的核酸檢體，其是利用經標定的引物所擴增出APOE基因片段，諸如于一聚合酶鏈式反應中以經標定的APOE引物對擴增而得的經標定的APOE基因片段。
[0017]所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”可為已知的任何APOE等位基因的序列所設計出，較佳的選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段，其中SNP rs429358為胸苷(thymidine, T)與rs7412為胞苷(cytidine, C)，即野生型正義探針；SNP rs429358為胞苷與rs7412為胸苷，即突變型正義探針；更佳的，APOE等位基因的核苷酸探針具有與E2、E3、E4型基因序列互補的序列，即野生型或突變型負義探針。
[0018]依據本發明，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”的大小介于16至25核苷酸，其熔點溫度(melting point temperature, Tm)為 50°C至 65°C。
[0019]較佳的，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”的大小介于16至22核苷酸，其熔點溫度(melting point temperature, Tm)為 5CTC至 6CTC。
[0020]依據本發明，所述的第一 SNP檢測區與第二 SNP檢測區可依照需求予以設置于薄膜墊選定的位置，而不限于第一 SNP檢測區介于結合墊與第二 SNP檢測區之間。另可選擇的，第二 SNP檢測區介于結合墊與第一 SNP檢測區之間。
[0021 ]依據本發明，所述的第一 SNP檢測區還可包含一第五檢測線和/或第六檢測線，而第二 SNP檢測區更可包含一第七檢測線和/或第八檢測線，其中與第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針為突變型負義探針以及野生型負義探針相對應的第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針為野生型正義探針與突變型正義探針。類似的情形適用于第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針。
[0022]較佳的，所述的“ΑΡ0Ε等位基因的核苷酸探針”具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.8任一所示序列。第一檢測區與第二檢測區的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線的相對排列位置，可依據需求選擇具有特定序列的APOE等位基因的核苷酸探針，達到避免噪聲產生或避免非所欲的因素影響結果。
[0023]較佳的，所述的第一 SNP檢測區的第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們涵蓋同一 APOE的SNP位點，亦即第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針的序列只有一個核苷酸的差異。例如，但不限于:所述的差異對應于APOErs429358的SNP位點，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ IDN0.2所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。類似的，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.4所示序列。
[0024]承上所述，與第一檢測線、第二檢測線不同，第二 SNP檢測區的第三檢測線、第四檢測線為涵蓋另一 APOE的SNP位點的APOE等位基因的核苷酸探針。較佳的，所述的第二SNP檢測區所涵蓋的APOE的SNP位點為APOE rs7412。例如，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而于第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6所示序列，其涵蓋的rs7412位點為T。類似的，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.8所示序列。
[0025]由于所述的APOE等位基因的核苷酸探針為涵蓋諸如APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段，因此當待測對象的檢體被施用于所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，可藉由第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線是否產生訊號，以及訊號的組合形式，決定待測對象的APOE等位基因型是E2/E2、E2/E3、E3/E3、E2/E4、E3/E4或E4/E4，進而提供罹患晚發型阿茲海默癥的風險為低至高的判斷結果。
[0026]綜上所述，本發明藉由將涵蓋不同的APOE等位基因的單核苷酸多態性(singlenucleotide polymorphism, SNP)位點的核苷酸探針,依照預定的側向流方向固定于薄膜墊的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線及第四檢測線，施用樣品溶液于樣品墊，經反應后，比較參照第一 SNP檢測區與第二 SNP檢測區的第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線及第四檢測線的訊號，而可以于單一步驟反應中專一且準確的測定待測對象的APOE的SNP基因型，而判定APOE等位基因型，提供罹患晚發型阿茲海默癥風險的預測，以作為預防與治療的依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是本發明的較佳實施例的俯視示意圖。
[0028]圖2是圖1的側視剖面示意圖。
[0029]圖3是本發明的薄膜墊的操作原理示意圖。
[0030]圖4A至圖4F為本發明的較佳實施例的實施狀態參考圖。
[0031]圖5是現有技術APOE多態性的示意圖。
[0032]圖中符號說明:
[0033]10 基板
[0034]20樣品墊
[0035]30吸附墊
[0036]40結合墊
[0037]50薄膜墊
[0038]511第一檢測線
[0039]512第二檢測線
[0040]521第三檢測線
[0041]522第四檢測線
[0042]53控制線
【具體實施方式】
[0043]本發明的一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其包含一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結合墊、薄膜墊依序排列設置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設有一第一 SNP檢測區、一第二 SNP檢測區以及一控制線，其中第一SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，以及第二 SNP檢測區包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線以及第四檢測線分別固定一 APOE等位基因的核苷酸探針。所述的阿茲海默癥基因檢測裝置是將樣品墊20、吸附墊30、結合墊40、薄膜墊50固定于基板10上而組裝成。
[0044]所述的第一 SNP檢測區的第一檢測線511、第二檢測線512各自具有一 APOE等位基因的核苷酸探針，所述APOE等位基因的核苷酸探針彼此之間具有一核苷酸差異，通過第一 SNP檢測區的第一檢測線、第二檢測線訊號，可以判斷待側對象的APOE基因的特定位點的單核苷酸多態性。
[0045]在本發明的一較佳實施例中，第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋同一 APOE的rs429358SNP位點，二者只有一個核苷酸的差異，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。在本發明的另一較佳實施例中，第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.3所示序列，其涵蓋的rs429358位點為C，而第二檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.4所示序列，其涵蓋的rs429358位點為T。
[0046]在本發明的一較佳實施例中，第三檢測線、第四檢測線為涵蓋APOE的SNPrs7412位點的APOE等位基因的核苷酸探針，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQID N0.5所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而于第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID勵.6所示序列，其涵蓋的1^7412位點為1'。在本發明的另一較佳實施例中，第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針亦可具有SEQ ID N0.7所示序列，其涵蓋的rs7412位點為C，而第四檢測線所具APOE等位基因的核苷酸探針為SEQ ID N0.8所示序列，其涵蓋的rs7412位點為T。
[0047]在本發明的一較佳實施例中，所述阿茲海默癥基因檢測裝置具有主要如上述所述的結構，除此之外，其中第一 SNP檢測區還可包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二SNP檢測區還可包括一第七檢測線、一第八檢測線。
[0048]在本發明的一較佳實施例中，第一檢測區包括第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們為涵蓋SNP rs4293582位點的野生型與突變型正義、負義探針，如選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區包括第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針，它們為涵蓋SNP rs7412位點的野生型與突變型正義、負義探針，如選自于SEQID N0.5至SEQ ID N0.8所示序列的核苷酸探針。如前所述，當正義、負義探針同時存在時，作為檢測結果的準確性的重復確認，而更進一步避免假性檢測結果發生。
[0049]在本發明的另一較佳實施例中，第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8，第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針各自為具有SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示不同序列的核苷酸探針；而第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4，第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針各自為具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示不同序列的核苷酸探針。
[0050]在本發明的一較佳實施例中，結合墊的標定物是由膠體金、酶、熒光物質、染料、碳黑或乳膠與一能夠專一性辨識經標定的APOE基因片段的分子所形成的。例如，與膠體金結合的抗Dig抗體。如本領域所知曉的，可以依據需求選擇適當的標定物，并針對標定物的物理或化學性質變化所產生的訊號，偵測經標定的APOE基因片段的存在與否。
[0051]本發明藉由下列實施例作為例示說明，以使得所請發明的范疇更為清楚，而不應作為解釋保護范圍的限制。
[0052]實施例
[0053]阿茲海默癥基因檢測裝置的制造
[0054]如圖1與圖2所示，本實施例提供一阿茲海默癥基因檢測裝置，其包括一基板10、一樣品墊20、一吸附墊30、一結合墊40以及一薄膜墊50，其中基板10的一側面的一端設置樣品墊20，基板10的該側面的另一端設置吸附墊30，位于樣品墊20與吸收墊30之間并與樣品墊20鄰接設置結合墊40，結合墊40與吸附墊30之間設置薄膜墊50，薄膜墊50橫向平行設置有一第一 SNP檢測區51以及一第二 SNP檢測區52以及一控制線53，其中該第一SNP檢測區51包括一第一檢測線511和一第二檢測線512，該第二 SNP檢測區52包括一第三檢測線521和一第四檢測線522。
[0055]所述的阿茲海默癥基因檢測裝置的制備方式簡述如下，其與一般免疫層析檢測大致相同。首先提供一基板10、一樣品墊20、一吸附墊30、一結合墊40的本體以及一薄膜墊50，所述的基板10為塑料材料所制造而成；所述的樣品墊20為玻璃纖維所制成；所述的吸附墊30為纖維紙；所述的結合墊40的本體為玻璃纖維所制成；所述的薄膜墊50為硝化纖維素薄膜。
[0056]所述的結合墊40包括一本體與一標定物，此處的標定物為與膠體金結合的抗-Digoxigenin (Dig)抗體,其能夠辨識Dig,而能與經Dig標定的APOE基因片段結合,膠體金的聚集沉淀會呈現肉眼可見的顏色，可藉此判定與標定物結合的標的基因片段的存在與否。結合墊40是藉由將玻璃纖維本體浸潰于含有與膠體金結合的抗-Digoxigenin (Dig)抗體的溶液后干燥而得。
[0057]將卵白素(sti^ptavidin)與經生物素(b1tin)標定的具有SEQID N0.3,SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示序列的探針的混合溶液噴涂于薄膜墊50，形成四條間隔的并行線，形成所述的第一檢測線511、第二檢測線512、第三檢測線521、第四檢測線522，如圖3所示,藉以分別與rs429358為C、rs429358為T、rs7412為C、rs7412為T的APOE等位基因片段相結合。
[0058]將經生物素標定的rs429358突變型負義探針(注記為MAT)，即經生物素標定的具有如SEQ ID N0.3所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結合而固定于薄膜墊，以形成所述的第一檢測線511。
[0059]將經生物素標定的rs429358野生型負義探針(注記為WAT)，即經生物素標定的具有如SEQ ID N0.4所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結合而固定于薄膜墊，以形成所述的第二檢測線512。
[0060]將經生物素標定的rs7412野生型負義探針(注記為WAT)，即經生物素標定的具有如SEQ ID N0.7所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結合而固定于薄膜墊，以形成所述的第三檢測線521。
[0061]將經生物素標定的rs7412突變型負義探針(注記為MAT)，即經生物素標定的具有如SEQ ID N0.8所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針，通過與卵白素結合而固定于薄膜墊，以形成所述的第四檢測線522。
[0062]另于薄膜墊50第四檢測線522與吸附墊30之間涂布針對抗Dig抗體的二級抗體(Ant1-Dig secondary antibody),形成控制線53,以辨識標定與膠體金結合的抗Dig抗體，作為陽性反應的對照組。
[0063]將樣品墊20、吸附墊30、結合墊40、薄膜墊50固定于基板10上，組裝成所述的阿茲海默癥基因檢測裝置。
[0064]由檢體準備樣品溶液
[0065]取待測對象A、B、C、D、E及F的核酸檢體，使用經Dig標定的引物AP0E_A(SEQ IDN0.9)以及APOE-C (SEQ ID N0.10)，進行聚合酶鏈式反應擴增大小為303堿基對的經Dig標定的APOE基因片段，其涵蓋rs429358以及rs7412的SNP位點，并且齊備含有該經標定的APOE基因片段的樣品溶液A、B、C、D、E及F。
[0066]以阿茲海默癥基因檢測裝置分析檢體
[0067]配合參考圖3所示，將前述樣品溶液各自施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置的樣品墊10，使之均勻分布進入結合墊40，該經Dig標定的APOE基因片段于結合墊40中與膠體金結合的抗Dig抗體結合,膠體金結合的抗Dig抗體與經Dig標定的APOE基因片段通過毛細現象繼續移動進入薄膜墊50，第一檢測線511、第二檢測線512、第三檢測線521、第四檢測線 522 的具有如 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8 所示序列的APOE等位基因的核苷酸探針會專一'丨生的與結合有膠體金結合的抗Dig抗體的經Dig標定的APOE基因片段反應，而膠體金聚集而顯現顏色，沒有作用的膠體金結合的抗Dig抗體會與控制線53的針對抗Dig抗體的抗體結合而顯現顏色。
[0068]樣品溶液A施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4A所示，顯示樣品溶液A中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區的第四檢測線522結合，表示檢體A的APOE等位基因型為E2/E2型。
[0069]樣品溶液B施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4B所示，顯示樣品溶液B中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區51的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區52的第三檢測線521、第四檢測線522結合，表示檢體B的APOE等位基因型為E2/E3型。
[0070]樣品溶液C施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4C所示，顯示樣品溶液C中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區51的第一檢測線511、第二檢測線512以及第二 SNP偵測區52的第三檢測線521、第四檢測線522結合，表示檢體C的APOE等位基因型為E2/E4型。
[0071]樣品溶液D施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4D所示，顯示樣品溶液D中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區51的第二檢測線512以及第二 SNP偵測區52的第三檢測線521結合，表示檢體D的APOE等位基因型為E3/E3型。
[0072]樣品溶液E施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4E所示，顯示樣品溶液E中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區51的第一檢測線511、第二檢測線512以及第二 SNP偵測區52的第三檢測線521結合，表示檢體E的APOE等位基因型為E3/E4型。
[0073]樣品溶液F施用于一阿茲海默癥基因檢測裝置，結果如圖4F所示，顯示樣品溶液F中經Dig標定的APOE基因片段與第一 SNP偵測區51的第一檢測線511以及第二 SNP偵測區52的第三檢測線521結合，表示檢體F的APOE等位基因型為E4/E4型。
[0074]基于上述檢測結果可見，所述樣品溶液制備后施用于所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，可于單一的步驟于檢測線位置呈現顏色，顯示檢體A-F的來源待檢測對象的APOE等位基因型分別為E2/E2型、E2/E3型、E3/E3型、E2/E4型、E3/E4型、E4/E4型，判定所屬檢測對象罹患晚發型阿茲海默癥的風險分別為低至高。
【權利要求】
1.一種阿茲海默癥基因檢測裝置，其包含一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結合墊、薄膜墊依序排列設置于基板的一表面上并且彼此相互連接；薄膜墊設有一第一 SNP檢測區以及一控制線，其中第一 SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，第一檢測線、第二檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。
2.如權利要求1所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中APOE等位基因的核苷酸探針選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段。
3.如權利要求2所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs429358SNP位點。
4.如權利要求3所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中薄膜墊還設有一第二SNP檢測區，第二 SNP檢測區包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第三檢測線以及第四檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。
5.如權利要求4所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs7412SNP位點。
6.如權利要求1至5任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.4所示序列。
7.如權利要求4或5所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
8.如權利要求6所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
9.如權利要求1至5中任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中APOE等位基因的核苷酸探針的大小介于16至25核苷酸，其熔點溫度為50°C至65°C。
10.如權利要求1至5中任一項所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第一SNP檢測區還可包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二 SNP檢測區還可包括一第七檢測線、一第八檢測線。
11.如權利要求4所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針分別具有SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8 所示序列。
12.如權利要求10所述的阿茲海默癥基因檢測裝置，其中第一檢測區的第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區的第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示序列的核苷酸探針。
13.一種檢測阿茲海默癥的方法，其包含: 提供一阿茲海默癥基因檢測裝置，其包括一基板、一樣品墊、一結合墊、一薄膜墊以及一吸附墊，其中樣品墊、結合墊、薄膜墊依序排列設置于基板的一表面上并且彼此相互連接；其中結合墊具有一標定物；薄膜墊設有一第一 SNP檢測區以及一控制線，其中第一 SNP檢測區包括一第一檢測線以及一第二檢測線，第一檢測線、第二檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第一檢測線、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異； 將一含有經標定的APOE基因片段的溶液施用于樣品墊，使該經標定的APOE基因片段朝向結合墊移動，經標定的APOE基因片段與標定物結合形成一復合物，繼而朝向薄膜墊移動，所述的復合物與第一 SNP檢測區的第一檢測線和/或第二檢測線結合而產生訊號；以及 依據第一 SNP檢測區的該第一檢測線和/或第二檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型。
14.如權利要求13所述的方法，其中APOE等位基因的核苷酸探針選自于涵蓋APOE的SNP rs429358或rs7412位點的APOE基因序列片段。
15.如權利要求14所述的方法，其中第一、第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋 APOE 的 rs429358SNP 位點。
16.如權利要求15所述的方法，其中薄膜墊還設有一第二SNP檢測區，第二 SNP檢測區包括一第三檢測線以及一第四檢測線，第三檢測線以及第四檢測線分別具有APOE等位基因的核苷酸探針，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有一核苷酸的差異。
17.如權利要求16所述的方法，其中第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針涵蓋APOE的rs7412SNP位點。
18.如權利要求13至17任一項所述的方法，其中第一檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列，而第二檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.4所示序列。
19.如權利要求16或17所述的方法，其中第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示序列。
20.如權利要求18所述的方法，其中第三檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示序列，而第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針具有SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.8 所示序列。
21.如權利要求13至17中任一項所述的方法，其中APOE等位基因的核苷酸探針的大小介于18至25核苷酸，其熔點溫度為55°C至60°C。
22.如權利要求13至17中任一項所述的方法，其中第一SNP檢測區還可包括一第五檢測線、一第六檢測線，以及第二 SNP檢測區還可包括一第七檢測線、一第八檢測線。
23.如權利要求16所述的方法，其中第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線、第四檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針分別具有SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7及SEQID N0.8所示序列。
24.如權利要求22所述的方法，其中第一SNP檢測區的第一檢測線、第二檢測線、第五檢測線、第六檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.4所示序列的核苷酸探針；而第二檢測區的第三檢測線、第四檢測線、第七檢測線、第八檢測線的APOE等位基因的核苷酸探針是選自于SEQ ID N0.5至SEQ ID N0.8所示序列的核苷酸探針。
25.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第二檢測線與第四檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E2/E2型。
26.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第二檢測線、第三檢測線與第四檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E2/E3型。
27.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第一檢測線、第二檢測線、第三檢測線與第四檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E2/E4型。
28.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第二檢測線與第三檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E3/E3型。
29.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第一檢測線、第二檢測線與第三檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E3/E4型。
30.如權利要求23所述的方法，其還包括依據第二SNP檢測區的該第三檢測線和/或第四檢測線訊號的存在，判斷該APOE基因片段的基因型；以及 第一檢測線與第三檢測線產生訊號，判斷APOE基因片段的來源的基因型為E4/E4型。
【文檔編號】C12M1/34GK104178418SQ201310670380
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年5月28日
【發明者】關淑君, 林詠翔, 施惠馨, 黃雪茵, 蔡岳穎 申請人:大江基因醫學股份有限公司