基于耗氧速率our為控制參數的利福霉素sv的發酵生產方法
【專利摘要】一種基于耗氧速率OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中海諾卡氏菌作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生成利福霉素SV的。在發酵制備工序，通過控制發酵過程中發酵罐的攪拌轉速和通氣流量來達到不同的供氧水平，具體是在發酵過程前期70~75小時內維持發酵體系高水平的耗氧速率OUR在18~20mmol/L/h之間，使得菌絲快速生長，效價快速升高，發酵過程前期用時70~75小時之后，通過降低發酵罐的攪拌轉速和通氣流量，將耗氧速率OUR控制在13~15mmol/L/h之間，直到放罐終點。本發明促進了菌體生長和利福霉素SV的合成，提升了轉化率，縮短了生產周期，穩定提高了發酵生產水平，使得利福霉素SV的產量得到提高。
【專利說明】基于耗氧速率OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利福霉素SV的發酵生產方法，具體是一種基于耗氧速率OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，特別與利福霉素SV發酵生產中的過程控制有關。
【背景技術】
[0002]利福霉素類抗生素是由地中海鏈絲菌產生的一類抗生素，它具有廣譜抗菌作用，對結核桿菌、麻風桿菌、鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽性細菌，特別是耐藥性金黃色葡萄球菌的作用都很強。對某些革蘭氏陰性菌也有效。利福霉素類藥物有:利福霉素B 二乙酰胺、利福平等。目如在臨床應用的有利福平、利福噴汀及利福布汀。這些藥物的直接如體都是利福霉素SV。在現行的利福霉素SV批培養發酵工藝中，大多僅僅采用pH、DO、溫度等作為控制策略的依據和手段。這些參數大多數情況僅僅能反應出設備的性能或者操作條件，而不能實時的、真實的反應出微生物的生理狀態。利福霉素發酵過程屬于耗氧發酵，供氧對生產菌株的生長和產物形成有著重要的影響。在利福霉素發酵過程中，必須提供合適的攪拌和通氣，菌體才能繁殖和積累所需代謝產物。此外，在不同發酵階段的菌體的需氧量是不同的，發酵液的供氧能力的大小直接影響微生物的酶的活性、代謝途徑及產物產量。因此研究供氧大小對發酵的影 響及控制對提高生產效率，改善產品質量等都有重要意義。一般的耗氧發酵過程均控制較高的供氧以避免氧限制的發生，在這種情況下可以以溶解氧濃度(Dissolved Oxygen,簡稱DO)來表征供氧水平,通過控制攪拌轉速和空氣流量可以有效的控制D0。溶氧水平受供氧速率(OTR)和耗氧速率(OUR)兩方面影響。其中OTR的影響因素主要有發酵液的流變特性和操作參數，例如流量、攪拌轉速、攪拌漿型等。與DO和OTR不同的是，OUR是一個典型的生理參數，能反應出微生物真實的耗氧情況。通常來說，發酵一般會將溶氧水平控制在臨界氧以上，否則，氧供應就會成為限制性因素，OUR就會隨著OTR的變化而變化，這種情況一般是不利于發酵進行的。另一個比較重要的生理參數是呼吸商(RQ)，RQ是二氧化碳釋放速率(CER)和OUR的比值。RQ會隨著代謝途徑和通量的變化而變化，換句話就是，通過RQ可以實時在線的監控發酵過程中微生物的代謝狀態。
[0003]已報道的利福霉素SV發酵相關的技術研究主要集中在通過基因工程改造技術來提高利福霉素的生產水平，或通過菌種誘變處理、簡單的氮源和磷酸鹽濃度的單因素優化調整實驗來考察其對產物合成的影響，也有的專利文獻報道采用通過調整過程的補料速率來優化發酵生產過程。這些技術只是從單因素的考察角度來研究對利福霉素SV發酵的影響，當然為生產水平的提升也起到了一定的作用，但這些研究缺乏從菌體的動態生理代謝過程的角度分析生物代謝過程，都沒有找到合適的辦法來考察和控制發酵過程中對利福霉素SV發酵影響最重要的氧消耗水平，以達到提高產能的目的。發酵生產過程中不足或過度的氧供應水平控制，會嚴重影響生產工藝的穩定性，帶來生產成本高、產率低、合格率低等問題。
[0004]通過檢索，發明人查到了以下相關專利文獻:CN103184260A公開了一種高含量紅霉素B發酵液的發酵方法，該發酵方法是在以紅色鏈霉菌為菌種發酵生產紅霉素的過程中，控制發酵液的通氣量和攪拌轉速使發酵液的溶解氧含量保持在(Tl5%。通過在溫度31~37°C，pH在6.Tl.3的發酵體系中，控制通入無菌空氣的通氣比和攪拌轉速來控制發酵過程中的溶解氧含量，使代謝途徑發生改變，從而有效提高紅霉素B的積累，提高發酵液中紅霉素B的含量，為提純紅霉素B提供原料。CN102660598A公開了一種提高利福霉素SV發酵產量的方法。在發酵培養的過程中，將終濃度為0.2^0.5g/L的乙二酸鹽、2~5mL/L的豆油無菌補入發酵培養地中海擬無枝酸菌周期在6(T80h的發酵罐內。CN102703541A公開了一種提高利福霉素SV發酵產量的補料方法，在發酵培養的過程中，將終濃度為0.3^0.8g/L的丙氨酸、2~5mL/L的豆油和3~20mg/L的磷霉素鈉或終濃度為0.3~0.8g/L的丙氨酸、2飛mL/L的豆油和3~20mg/L的磷霉素氨丁三醇無菌補入發酵培養地中海擬無枝酸菌周期在6(T80h的三級發酵罐內，培養結束時利福霉素SV效價平均提高17.0%。以上這些專利文獻對于本發明如何能穩定提高發酵生產水平、使得利福霉素SV的產量得到提高，并未給出具體的技術指導方案。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題在于，提供一種基于耗氧速率OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，該生產方法能穩定提高發酵生產水平，使得利福霉素SV的產量得到提聞。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
一種基于耗氧速率(攝氧率)OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中海諾卡氏菌作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生成利福霉素SV的，具體工藝步驟包括斜面的制備 工序、母瓶種子制備工序、一級種子制備工序、二級種子制備工序、發酵制備工序，其技術方案在于:在發酵制備工序，通過控制發酵過程中發酵罐的攪拌轉速和通氣流量(通氣比)來達到不同的供氧水平，即通過調節攪拌轉速、通氣比來實現氧消耗水平的精確控制，具體是在發酵過程前期7(T75小時內維持發酵體系高水平的耗氧速率OUR在18^20mmol/L/h之間，使得菌絲快速生長，效價快速升高，發酵過程前期用時70~75小時之后，通過降低發酵罐的攪拌轉速和通氣流量，將耗氧速率OUR控制在13~15mmol/L/h之間，直到放罐終點(發酵終點)。從而促進菌體生長和利福霉素SV的合成，提升轉化率和縮短生產周期。
[0007]上述技術方案中，所述發酵過程中氧消耗速度水平的降低(耗氧速率的降低)最好是階段式降低控制、連續下降或逐步降低。上述發酵過程前期70~75小時內維持發酵體系高水平的耗氧速率OUR最好為19.lmmol/L/h。上述發酵過程前期用時70~75小時之后，將耗氧速率OUR最好控制在14.2mmol/L/h。上述利福霉素SV的產物合成量≥7300mg/L~7500mg/L。
[0008]本發明人通過控制發酵過程中不同的攪拌轉速和通氣流量來控制不同的供氧水平。實驗在50L小試規模進行。
[0009]儀器和試劑:
發酵罐:上海國強生化裝備有限責任公司15L和50L自動發酵罐；
儀器:ExtralMAX30 — LG過程質譜儀；國家生化工程中心Biostar軟件包；722型紫外一可見分光光度計；旋轉式搖床 。
[0010]培養方法:利福霉素發酵采用三級發酵，其中包括二級種子發酵。
[0011]母瓶種子培養:在IL三角瓶中裝種子培養基IOOmL,斜面接種后搖床培養，培養溫度28°C，轉速220rpm，培養約48小時。
[0012]種子罐:15L種子罐中裝量8L，將母瓶種子按10%_15%接種量接種，培養溫度28~29°C，用轉速和空氣空氣控制溶氧水平不低于35%，自然pH控制，培養周期約50小時。
[0013]發酵罐:50L發酵罐裝量30L，用經過蒸氣滅菌的管道從15L種子罐中移種5L，溫度控制在26~29°C，用轉速和通氣控制OUR水平為18mmol/L/h，70小時后OUR水平為15mmol/L/h,自然pH控制,過程中補加葡萄糖和水,培養周期約130~140小時。
[0014]測定方法:
還原糖測定:DNS方法。
[0015]生物量測定:離線測定采用濕體積法，將IOmL發酵液置于離心管，3000rpm離心15min，將離心上清倒入量筒，根據上清的體積計算出發酵液的體積。在線采用美國Aber公司的活細胞傳感器，其原理是根據細胞在電場下被極化，形成多個電容，電容值的大小與活菌量成正比。所以，可以采用電容值大小來估計活菌的量。
[0016]效價測定:采用國家藥典方法。
[0017]pH、DO在線測定:采用Mettler Toledo耐高溫電極進行在線測定。
[0018]溫度:鉬溫度電極在線測定。
[0019]進氣和尾氣中氧和二氧化碳的測定:采用美國Extrel過程質譜MAX300-LG對發酵過程中的進氣和尾氣進行實時在線采集分析。
[0020]耗氧速率OUR和二氧化碳生成速率CER測定:0UR和CER的計算通過對發酵尾氣的分析數據計算得到。以進氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的計算公式如下:
【權利要求】
1.一種基于耗氧速率OUR為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中海諾卡氏菌作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生成利福霉素SV的，具體工藝步驟包括斜面的制備工序、母瓶種子制備工序、一級種子制備工序、二級種子制備工序、發酵制備工序，其特征在于: 在發酵制備工序，通過控制發酵過程中發酵罐的攪拌轉速和通氣流量來達到不同的供氧水平，具體是在發酵過程前期7(T75小時內維持發酵體系高水平的耗氧速率OUR在18~20mmOl/L/h之間，使得效價快速升高，發酵過程前期用時7(T75小時之后，通過降低發酵罐的攪拌轉速和通氣流量，將耗氧速率OUR控制在13~15mmol/L/h之間，直到放罐終點。
2.根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于上述發酵過程中氧消耗速度水平的降低即耗氧速率的降低是階段式降低控制、連續下降或逐步降低。
3.根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于上述發酵過程前期7(T75小時內維持發酵體系高水平的耗氧速率OUR為19.lmmol/L/h。
4.根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于上述發酵過程前期用時7(T75小時之后，將耗氧速率OUR控制在14.2mmol/L/h。
5.根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于上述利福霉素SV的產物合成量≥7300mg/L~7500 mg/L。
【文檔編號】C12P17/18GK103642870SQ201310668982
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】李海東, 劉愛軍, 王澤建, 賈軍巧, 張鑫, 莊英萍, 張嗣良, 張婭 申請人:河北欣港藥業有限公司, 華東理工大學