基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法

基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，在洗凈的金電極上滴加捕獲探針，冰箱中過夜后取出封閉，在金電極上滴加待測樣品，反應完后再滴加環化DNA，反應，滾環擴增，再加入金納米探針，雜交，進行DPV信號檢測。本發明選用沙門菌高度保守的invA基因，設計與其特異性結合的探針，結合滾環擴增與金納米技術，利用電化學技術檢測沙門菌invA基因，靈敏度上有了極大的改善，使得檢測的線性范圍達到100aM～10pM，靈敏度為：100aM。污染牛奶中沙門菌檢測范圍為20～6×108CFU?mL-1的沙門菌，最低檢測限為20CFU?mL-1。本發明構建了快速和超靈敏檢測沙門菌的方法，極大提高了檢測的靈敏度，具有檢測設備小型化、簡便快速和檢測成本低的特點。
【專利說明】基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種沙門菌基因的檢測方法，尤其涉及一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，屬于生物檢測領域。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌屬腸桿菌科，是革蘭陰性腸道桿菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙門氏菌感染后主要引起食物中毒、胃腸炎、傷寒和副傷寒。有研究表明，沙門氏菌的侵襲蛋白與其致病性密切相關，決定著細菌進入宿主上皮細胞的能力。它主要由一系列基因編碼，其中invA是編碼沙門菌侵染上皮細胞表面蛋白的基因，與該菌致病性密切相關，是沙門菌特有的。
[0003]目前，最常用的腸道致病菌檢測方法主要有三種:傳統的分離培養鑒定、酶聯免疫吸附法(ELISA)和聚合酶鏈式反 應(PCR)。傳統的分離培養鑒定法是將細菌分離培養后通過菌落計數和菌落形態、染色特征、生化反應等方法對細菌進行鑒定，該方法是細菌鑒定的金標準方法，但是其耗時費力。ELISA方法是基于抗原抗體反應的免疫學檢測，與傳統的分離培養鑒定方法相比較，縮短了檢測時間，但是仍然需要細菌培養這一步，至少需要24~48小時才能得出準確的結果，而且該方法的檢測限一般為> IO5CFU mL—1，難以滿足低濃度細菌的檢測。PCR技術與上述兩種方法相比較，優點是較高的靈敏度，但是PCR結果容易出現假陽性；目前實驗室主要用凝膠電泳技術來檢測PCR擴增的片段，但是凝膠電泳技術的分辨率較低且需要較高精確度的熱循環儀，因此限制了 PCR技術在實驗室檢測細菌的廣泛運用。另一方法，不使用熱循環儀的核酸依賴的擴增(NASBA)和自主序列復制系統(ASR)，在特異性上又大打折扣，主要是由于必須用一個相對較低的溫度40°C來進行擴增。鏈置換擴增術(SDA)利用四種引物在等溫條件下擴增，很大程度上克服了這些缺陷，但是仍然存在薄弱的環節:必須利用昂貴的修飾核苷酸作為底物來進行擴增反應。
[0004]生物學研究領域中經常遇到一些不能直接擴增的待測分子，且由于其濃度較低而無法檢測，因而信號放大技術對不能進行直接擴增的低濃度待測分子的檢測顯得尤為重要。核酸分子體外擴增是生物技術研究的重要手段，如用于病毒檢測和遺傳病點突變檢測方面的連接酶鏈式反應(LCR)、支鏈DNA信號放大系統(bDNA)和侵染探針技術(Invader)；用于快速準確檢測和定量分析RNA的NASBA和轉錄介導的擴增(TMA);用于檢測目的DNA片段的Qi3復制等。目前為止，聚合酶鏈式反應(PCR)和滾環擴增(rolling circleamplification, RCA)仍是使用較多的擴增技術。RCA是新近發展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環狀模板互補)，在酶催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復模板片段。這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。RCA技術的優勢是:高靈敏度、高特異性、簡單、易操作、多元性、高通量。
[0005]納米顆粒是一種人工合成的微小顆粒，它的形態可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C.A., et al ；)發現表面修飾有核酸探針的13nm金顆粒溶液中加入與修飾核酸互補配對的目標核酸分子時，由于金顆粒聚集導致溶液的顏色由紅變藍。自此利用納米顆粒來進行生物分子檢測的研究得到廣泛應用。目前通用的方法主要分為兩種，一種是利用在金或銀納米顆粒修飾核酸探針，根據溶液的顏色變化來檢測目標核酸分子，優點是檢測方法簡單，但是所用的納米顆粒成本較高?’另一種是利用在顆粒表面修飾核酸分子，通過不同的核酸擴增手段后加入熒光探針來進行目標分子檢測，優點是檢測的靈敏度高，但是熒光探針的成本也較高。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題在于構建快速和超靈敏檢測沙門菌invA基因的方法，選用沙門菌高度保守的invA基因，設計與其特異性結合的探針，利用滾環擴增與金納米技術，用電化學策略檢測沙門菌，提供一種檢測設備小型化、簡便快速、靈敏度高、檢測成本低的檢測方法。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，包括以下步驟:
[0008]1)將裸金電極拋光，洗滌，然后浸入食人魚溶液中10~15min，再取出清洗、干燥；
[0009]2)將巰基標記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜；
[0010]3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ；
[0011]4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加待測樣品溶液，37°C反應I~1.5h，然后在金電極上滴加提前制備好的環化DNA，37°C反應I~1.5h ;
[0012]5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滾環擴增反應液，37 °C滾環擴增I~1.5h ;
[0013]6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2XSSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極；
[0014]7)在步驟6中的金電極上加入用含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應30~45min，用DEA緩沖液沖洗后，置入用DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行差動脈沖伏安法DPV信號檢測，所得信號用標準曲線法或標準對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
[0015]所述步驟I中金電極拋光用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉，所述的食人魚溶液為濃H2SO4IH2O2體積比為3:1的溶液。
[0016]所述的巰基標記的捕獲探針序列為:5’ -SH-(CH2)6- TTTTTTTTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制備金納米探針的用巰基標記的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’，制作環化模板 DNA 時所用的待環化模板 DNA 序列為:5’ -p-CTCAGCTGTGTAA CAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATC GCTTATTATG TCCTATC-3'，探針 2 序列:5’ - AATACTCATCTGTTTACCGGGCA TAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3，。
[0017]所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液為含有
0.1M 氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, ρΗ7.4。
[0018]所述步驟3中的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/ml的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制。
[0019]所述步驟5中的滾環擴增反應液中含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，pH7.5。
[0020]所述步驟6中的2 X SSC雜交液含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6。
[0021]該方法沙門菌特異性的invA基因檢測的線性范圍為IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為=IOOaM0
[0022]有益效果:本發明選用沙門菌高度保守的invA基因，設計與其特異性結合的探針，結合滾環擴增與金納米技術，基于其信號放大作用，利用電化學技術檢測沙門菌，檢測限上有了極大的改善，invA基因檢測靈敏度達到IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為:100aM。污染牛奶中沙門菌檢測范圍為20~6 X IO8CFU ml/1的沙門菌，最低檢測限為20CFU mL—1。本發明構建了快速和超靈敏檢測沙門菌invA基因的方法，極大提高了檢測的靈敏度，在檢測上不需要昂貴的儀器設備，具有檢測設備小型化、簡便快速、靈敏度高和檢測成本低的特點。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發明的檢測原理示意圖；
[0024]圖2為本發明的沙門菌invA基因濃度與電流信號線性關系圖；
[0025]圖3為本發明的傳感器特異性考察圖，其中Comp I ement為沙門菌靶序列，Non-complement為作為對照的非完全互補序列，Blank為空白對照；
[0026]圖4為本發明的沙門菌濃度與電流信號線性關系圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明:
[0028]本發明中的ST-AP 為 Streptavidin-alkaline Phosphatase,中文名稱為親和素標記堿性磷酸酶，購自Sigma公司(美國)。
[0029]本發明中的α-NP為a-Naphthyl Phosphate,中文名稱為1-萘基磷酸酯,購自Sigma公司(美國)。
[0030]本發明中的BSA為bovine serum albumin,中文名稱為小牛血清白蛋白，購自Sigma公司(美國)。
[0031]實施例一、制備環化DNA
[0032]將100nmol5’端磷酸化的待環化模板DNA與IOOnmol探針2混合于100 μ L連接緩沖液中(ρΗ7.5，50mM Tris, IOmM MgCl2, IOmM 二硫蘇糖醇，0.5mM ATP)，接著加入 0.2U 的T4DNA連接酶，于37°C連接反應60分鐘；65°C 10分鐘滅活T4DNA連接酶，得到的環化模板DNA在-20 V下保存備用。所用的5 ’端磷酸化的待環化模板DNA序列為:5 ’ -p-CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGAT CGCTTATTA TGTCCTATC-3',探針 2 序列為:5’ - AATACTCATCTGTTTACCG GGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。[0033]實施例二、金納米粒子和金納米探針的制備
[0034](1)用王水浸泡所有器皿24小時，用雙蒸水將其沖洗干凈備用。
[0035](2)配制1OOmL0.01%的HAuCl4.4Η20去離子水溶液，置于加熱磁力攪拌器上攪拌，待溶液煮沸后迅速加入4mLl%檸檬酸三鈉溶液。金納米粒子溶液顏色首先變黑，再逐漸變為酒紅色。繼續攪拌8~10分鐘后，關閉熱源并繼續攪拌冷卻至室溫，放入4°C冰箱內備用。
[0036](3)取9 μ LlOO μ M巰基標記的信號探針加入300 μ L上述步驟2中的金納米粒子溶液中，在磁力攪拌器上4°C過夜攪拌12小時。所述的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’。
[0037](4)在上述步驟3中過夜攪拌的金納米粒子溶液中加入0.5M NaCl老化，攪拌12小時。
[0038](5)步驟4中的溶液停止攪拌后收集至離心管8000rpm離心30分鐘，去除上清液，所得的DNA修飾的金納米探針溶于2 X SSC溶液(pH7.4，含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉)中放置于4°C冰箱保存備用。
[0039]實施例三、制備待檢樣品
[0040]一、提取用作PCR模板的基因組DNA
[0041]由于沙門菌感染很多是食源性的，因此通常可以用食品或者糞便作為檢測源。
[0042]用食品檢測:在無菌條件下進行操作，將待檢食品放入勻漿機中攪成勻漿，取25g(或mL)待檢樣品的勻漿用225mL緩沖蛋白胨水(BP)稀釋成1: 10的均質勻漿液。取1mL均質勻衆液置于離心管中，12000r/min離心5min,滅菌生理鹽水洗漆2次,最后用0.25mL蒸餾水懸浮，置于100°C水浴中孵育15分鐘然后立即置于冰中。在4°C以12000r/min離心10分鐘后，將上清液轉移至新管中，該上清液中即含有可以直接用作PCR模板的基因組DNA。
[0043]用糞便檢測:取腹灣患者糞便標本200mg,使用QIAamp DNA Stool MiniKit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA, Cat N0.51504)試劑盒進行 DNA 的分離提取,具體步驟按照說明書操作。
[0044]二、擴增得到待檢的PCR產物樣品
[0045]配制PCR反應液，含有:取步驟一中來源于食品或者糞便的含有基因組DNA的上清液 5.0 μ L，20 μ M 的正反向引物各 L O μ L，25 μ L 的 Premix Taq(l.25U DNApolymerase, 2XTaq buffer, 0.4mM dNTPs)和 18 μ L 水，PCR 反應的最終體積為 50 μ L。根據沙門菌高度保守的invA基因，利用NCBI網站的Primer Blast模塊設計invA基因的擴增引物，正向引物序列為:5 ’ -GCATCCGCA TCAATAATACCG-3 ’，反向引物序列為:5’ -TTCTCTGGATGGTATGCCC-3’。PCR反應條件如下:95°C預變性1分鐘；接著95°C變性30秒，51°C退火30秒，72°C引物延伸30秒，35個循環，最后72°C延伸4分鐘。擴增產物保藏于4°C冰箱備用，即得到待檢樣品。
[0046]實施例四、基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，按照以下步驟進行:
[0047]1)將裸金電極用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉拋光，超聲清洗，然后浸入食人魚溶液中(濃H2S04:H202=3:1) 10~15min，用去離子水清洗金電極后室溫自然干燥；[0048]2)將10 μ L的IOOnM巰基標記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜。所述的疏基標記的捕獲探針序列為:
[0049]5，-SH-(CH2) 6 - TTTTTTTTTAATACCGGCCT TCAAATCGGCATC-3，。
[0050]3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ;所述的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/mL的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制；
[0051]4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加10 μ L待測樣品溶液37°C反應I~1.5h，然后在金電極上滴加10 μ L提前制備好的環化DNA，37 °C反應I~
1.5h ；
[0052]5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入10μ L含ImM dNTP,0.2U phi29DNA聚合酶的滾環擴增反應液(含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM 二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，ρΗ7.5)，37°C滾環擴增 I ~1.5h ;
[0053]6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2 X SSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極；所述的2 X SSC雜交液含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6 ；
[0054]所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液含有0.1M氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, pH7.4 ；
[0055]7)在步驟6中的金電極上加入用含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應30~45min，先用含有0.005%吐溫20的DEA緩沖液沖洗三次，再用不含吐溫20的DEA緩沖液沖洗三次，置入DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行DPV信號檢測，所得信號用標準曲線法或標準對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
[0056]電化學檢測DPV信號，DPV信號和沙門菌invA基因的濃度線性關系圖如圖2所示，計算得到其線性關系為:ip (A)=0.14XlgC+0.72，其中ip為電流信號強度，C為沙門菌invA基因濃度。根據得到的電流信號強度值，即可換算得到待檢樣品中的沙門菌invA基因的濃度值。
[0057]為了研究傳感器的特異性，非完全互補的合成DNAs被用來驗證。使用該方法分別檢測待檢樣品、非完全互補序列(序列為5’ - AGCGCAGCTGCGCAAT AGAATTGAAGAGGATTATGATGGCTACGTGAA - 3’)和空白對照，得到利用該方法檢測的傳感器特異性考察圖，如圖3所示，從特異性考察圖中可以看出非完`全互補序列的DPV響應值明顯低于靶DNA，信號值與空白信號相近。這些結果表明設計的傳感器能有效區分不同的DNA序列，表現出良好的選擇性。
【權利要求】
1.一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌irwA基因檢測的方法，包括以下步驟: 1)將裸金電極拋光，洗滌，然后浸入食人魚溶液中10~15min，再取出清洗、干燥； 2)將巰基標記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4°C冰箱中過夜； 3)將步驟2中的金電極取出，沖洗，用6-巰基-1-己醇封閉I~1.5h，再次沖洗金電極，然后用鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液封閉金電極30~40min ； 4)將步驟3中封閉后的金電極取出沖洗，在金電極上滴加待測樣品溶液，37°C反應I~1.5h，然后在金電極上滴加提前制備好的環化DNA，37°C反應I~1.5h ; 5)將步驟4中的金電極取出沖洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滾環擴增反應液，37°C滾環擴增I~1.5h ; 6)將步驟5中的金電極取出沖洗，加入用2X SSC雜交液配制的金納米探針，37°C雜交I~1.5h，用DEA緩沖液清洗電極； 7)在步驟6中的金電極上加入含有0.8%BSA的DEA緩沖液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反應30~45min，用DEA緩沖液沖洗后，置入用DEA緩沖液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中進行示差脈沖伏安法DPV信號檢測，所得信號用標準曲線法或標準對照法即可得到待檢樣品中沙門菌的濃度。
2.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟I中金電極拋光用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉，所述的食人魚溶液為濃H2SO4 = H2O2，體積比為 3:1。
3.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述的巰基標記的捕獲探針序列為:5 ’ -SH- (CH2) 6 - TTTTTT TTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制備金納米探針的用巰基標記的信號探針序列為:5’ -SH-(CH2) 6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTT TT-biotin-3，，制作環化 DNA 時所用的待環化模板 DNA 序列為:5’ -p-CTC AGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATG TCCTATC-3'，探針 2 序列為:5’ - AATACTCATC TGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3，。
4.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟3至6中金電極的沖洗按照如下步驟完成:先用含0.005%吐溫20的Tris-HCl緩沖液沖洗三次，然后再用Tris-HCl緩沖液沖洗三次，Tris-HCl緩沖液為含有0.1M 氯化鈉、5mM 氯化鎂、20mM Tris-HCl, ρΗ7.4。
5.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟3中的鮭魚精DNA和2%BSA混合溶液按濃度為10mg/ml的鮭魚精DNA與2%BSA體積比為1:80混合配制。
6.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌irwA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟5中的滾環擴增反應液中含50mM Tris, IOmM氯化鎂，33mM醋酸鉀，ImM二硫蘇糖醇，0.1%吐溫-20，pH7.5。
7.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟6中的2XSSC雜交液為含有0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸三鈉，pH7.4 ;所述DEA緩沖液為含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化鎂，IOOmM氯化鉀，pH9.6。
8.根據權利要求1所述的基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，其特征在于:沙門菌特 異性的irwA基因檢測的線性范圍為IOOaM~ΙΟρΜ，最低檢測限為:IOOaM0
【文檔編號】C12R1/42GK103614483SQ201310665170
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】丁世家, 周欽, 李劍波, 程偉, 顏玉蓉, 朱丹, 申波, 雷品華, 張偉, 李佳迅, 董芳 申請人:重慶醫科大學