醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法
【專利摘要】本發明涉及一種醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，屬于生物轉化【技術領域】。其步驟包括將含有環糊精的轉化液粗過濾回收固定化細胞，并將粗過濾是濾液經離心過濾、有機溶劑萃取后，所得的含有環糊精的萃余相除去殘留有機溶劑，分析水相中環糊精的剩余量，計算環糊精的補加量，按補加量加入環糊精后的水相和回收的固定化細胞重新用于醋酸可的松的生物催化，從而實現環糊精和固定化節桿菌的雙重循環利用，生物催化的清潔生產。本發明的技術穩定，節約生產成本，具有良好的應用前景。
【專利說明】醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于生物催化【技術領域】。具體涉及一種醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法。
【背景技術】:
[0002]環糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖的總稱，通常含有6~12個D-吡喃葡萄糖單元。研究較多且具有重要實際意義的是含有6、7、8個葡萄糖單元的分子，分別稱為a-CD、i3_CD和Y_CD。環糊精具有獨特的“內疏水” “外親水”的籠形結構，可以包結許多無機、有機和手性客體分子形成主-客體包結物，是目前最重要的具有包結作用的環狀化合物。近年來隨著許多新型環糊精衍生物的問世，如酯化、醚化，烷基化、羥基化等修飾而得到環糊精衍生物，可以改善環糊精的某些理化性質和包結能力，極大地擴展環糊精的應用領域。
[0003]在留體藥物中間體的生物催化過程中，留體底物的水難溶性一直是留體工業的關鍵和難點技術。利用環糊精的特殊性質，將環糊精與留體分子包結起來，可以有效提高甾體在水溶液中的溶解度，從而提高微生物對留體化合物的生物轉化效率。β -環糊精(β -cyclodextrin,簡稱β -⑶)及其衍生物能與留體底物作用，使其在水相容易分散,增強甾體底物與細胞的作用；也能作用于甾體催化的產物，減少甾體產物的反饋抑制。隨著環糊精及其衍生物在生物轉化領域的應用，環糊精在生物轉化方面的作用已相當明顯，應用也逐漸成熟，逐步走向工業生產階段。
[0004]但是，環糊 精的價格相對較高是目前限制其在生物催化技術中應用的主要原因。在環糊精介質生物催化反應體系中，利用環糊精的循環利用技術降低環糊精介質的利用成本，是環糊精催化介質在工業生物催化應用中亟待解決的重要技術問題。目前國內外關于疏水化合物生物催化反應中環糊精的循環利用技術還未見報道。
[0005]同時在利用游離細胞進行的生物催化反應中環糊精介質進行循環存在幾個問題:
[0006](I)細胞利用率低，游離細胞只能使用一次，成本高，污染大。
[0007](2)產物雜質多。利用游離細胞催化醋酸可的松生產醋酸潑尼松的反應體系中存留有大量的菌體、蛋白等雜質，增加了后續產物分離純化工藝的負擔，不利于環糊精的循環利用等。
【發明內容】
:
[0008]為了解決上述問題，本發明提供了一種醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法。
[0009]本發明的技術方案為:在以醋酸可的松為底物，環糊精為促溶劑，固定化細胞為催化劑的生物催化反應體系中，反應結束后
[0010](I)將含有環糊精的轉化液粗過濾回收固定化細胞；[0011](2)將粗過濾后的濾液離心、有機溶劑萃取；
[0012](3)將所得的含有環糊精的萃余相除去殘留有機溶劑；
[0013](4)測定水相中環糊精的剩余量，并補加環糊精；
[0014](5)將補加環糊精后的水相和回收的固定化細胞重新用于醋酸可的松的生物催化
中。
[0015]所述的環糊精為α-環糊精、β-環糊精、Y-環糊精、羥乙基環糊精、羥丙基-β -環糊精、羥丁基-β -環糊精、磺丁基-β -環糊精、葡萄糖基胺基-β -環糊精、甲基-環糊精或羥丙基-Y -環糊精中的一種。
[0016]所述的轉化液粗過濾采用紗布或20-50目的篩網進行過濾。
[0017]所述的萃取劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷中的一種或幾種。
[0018]所述的萃取劑與濾液的體積比為1-10:1,萃取次數為1-7次。
[0019]所述的除去殘留有機溶劑的方法為減壓蒸餾、蒸餾、精餾中的一種或多種。
[0020]所述的固定化細胞為簡單節桿菌固定化細胞或球形節桿菌固定化細胞。
[0021]所述環糊精的測定方法為:米用Phenomenex Luna NH2IOOA (4.6mmX 250mm, 5 μ m)色譜柱，流動相為乙腈-水=60:40 (v/v),流速1.0mL/min, RID示差折光檢測器，進樣量20 μ L,柱溫 30°C。
[0022]有益效果:
[0023](I)本發明可以實現環糊精和催化細胞的循環利用，實現疏水化合物生物催化清潔生產、環境友好,節約生產成本的要求。
[0024](2)本發明提供的方法工藝簡單、降低環糊精介質和制備細胞的成本，節約資源，帶來很大的經濟效益。
[0025](3)以循環5次使用的環糊精作為促溶劑的催化體系中，醋酸可的松的的轉化率仍然維持在93%以上，在高度節約成本的基礎上仍能維持較高的生產效率。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0026]圖1為羥丙基-β -環糊精(ΗΡ-β -⑶)和固定化細胞循環利用1-6次后醋酸可的松轉化率變化情況
【具體實施方式】:
[0027]下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
[0028]實施例1:
[0029]化合物醋酸可的松的C1;2位脫氫反應
[0030]微生物菌種采用節桿菌(Arthrobacter simplex) TCCC11037,它能實現甾體化合物的Cu2位脫氫轉化，將醋酸可的松轉化為醋酸潑尼松。
[0031]斜面培養基(g/L):葡萄糖10，酵母膏10，瓊脂20，pH7.0
[0032]種子培養基(g/L):葡萄糖10，玉米漿10，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，pH7.0
[0033]發酵培養基(g/L):葡萄糖10，玉米漿15，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5，ρΗ7.0[0034]間單節桿囷固定化細胞制備:
[0035]微生物在32°C，160r/min，30/250mL裝量條件下活化培養24h，取活化種子以5%接種量在裝量為30/250mL條件下發酵培養24h。將發酵培養獲得的細胞5000r/min離心后用PH7.2的Tris-HCl緩沖液洗滌三遍，重懸于pH7.2的Tris-HCl緩沖液中獲得靜息細胞。
[0036]將配制好的3%的海藻酸鈉溶液與靜息細胞等體積混合，攪拌均勻，制成海藻酸鈉一簡單節桿菌菌懸液。取此菌懸液IOOmL,在磁力攪拌下，用12號針頭的注射器滴加到300mL濃度為的3%的CaCl2溶液中，將膠珠在CaC12溶液中繼續浸泡2h，過濾，用Tris-HCl緩沖液洗滌二次，即得平均直徑為3mm的珠狀固定化簡單節桿菌細胞。
[0037]生物轉化:
[0038]取0.3g的醋酸可的松加入到30mL含有30mmol/L HP- β -CD的Tris-HCL緩沖液(ρΗ7.2-8.3)中，加入固定化簡單節桿菌細胞珠40粒。34°C、180r/min轉化8h，HPLC分析測定底物轉化率。
[0039]環糊精和固定化細胞的循環利用工藝:
[0040]取上述 生物轉化的轉化液，采用20目的網篩進行粗過濾回收固定化細胞，所獲得的固定化細胞可重新用于醋酸可的松的生物轉化。收集粗過濾液5000r/min離心lOmin，得到濾液和濾餅，加入兩倍濾液量的乙酸乙酯，萃取三次，萃余相45°C真空旋蒸除去殘留乙酸乙酯。采用Phenomenex Luna NH2100A(4.6mmX250mm, 5 μ m)色譜柱，流動相為乙腈-水=60:40 (v/v),流速1.0mL/min, RID示差折光檢測器，進樣量20 μ L,柱溫30°C分析水相中HP-β -⑶的剩余量為29.23mmol/L，補加0.77mmol/L HP-β -⑶后的含有環糊精的萃余相重新用于醋酸可的松的生物轉化。結果表明，環糊精和固定化簡單節桿菌細胞循環利用5次后，CA的最終轉化率仍在93%以上。
[0041]實施例2:
[0042]除以下內容外，其他同實施例1。
[0043]生物轉化中使用的環糊精為40mmol/L羥乙基_ β _環糊精。
[0044]環糊精和固定化細胞的循環利用工藝:
[0045]生物轉化的轉化液，采用30目的網篩進行粗過濾回收固定化細胞，所獲得的固定化細胞可重新用于醋酸可的松的生物轉化。收集粗過濾液5000r/min離心lOmin，得到濾液和濾餅，加入6倍濾液量的三氯甲烷，萃取三次，萃余相35°C真空旋蒸除去殘留三氯甲烷，分析水相中HP-β -⑶的剩余量為29.58mmol/L，補加0.42mmol/L HP-β -⑶后的含有環糊精的萃余相重新用于醋酸可的松的生物轉化。結果表明，環糊精和固定化簡單節桿菌細胞循環利用5次后，CA的最終轉化率仍在92%以上。
[0046]實施例3:
[0047]除以下內容外，其他同實施例1。
[0048]生物轉化中使用的環糊精為50mmol/L羥丙基-β-環糊精，底物為10g/L醋酸可的松。
[0049]環糊精和固定化細胞的循環利用工藝:
[0050]生物轉化的轉化液，采用紗布進行粗過濾回收固定化細胞。收集粗過濾液5000r/min離心lOmin，得到濾液和濾餅，加入3倍濾液量的二氯甲烷，萃取三次，萃余相30°C真空旋蒸除去殘留二氯甲燒，分析水相中ΗΡ-β -⑶的剩余量為29.42mmol/L,補加0.58mmol/LHP-β -CD后的含有環糊精的萃余相和回收的固定化細胞可重新用于醋酸可的松的生物轉化。結果表明，環糊精和固定化簡單節桿菌細胞循環利用5次后，CA的最終轉化率仍在94%以上。`
【權利要求】
1.一種醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:在以醋酸可的松為底物，環糊精為促溶劑，固定化細胞為催化劑的生物催化反應體系中，反應結束后，將含有環糊精的轉化液粗過濾回收固定化細胞，并將粗過濾是濾液經離心過濾、有機溶劑萃取后，所得的含有環糊精的萃余相除去殘留有機溶劑，測定水相中環糊精的剩余量，計算環糊精的補加量，按補加量加入環糊精后的水相和回收的固定化細胞重新用于醋酸可的松的生物催化中。
2.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的環糊精為α-環糊精、β-環糊精、Y-環糊精、羥乙基-β環糊精、羥丙基-β -環糊精、羥丁基-β -環糊精、磺丁基-β -環糊精、葡萄糖基胺基-β -環糊精、甲基-β -環糊精或羥丙基-Y -環糊精中的一種。
3.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的轉化液粗過濾采用紗布、20-50目的篩網等進行過濾。
4.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的萃取劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷中的一種或幾種。
5.根據權利要求1和4所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的萃取劑與濾液的體積比為1-10:1，萃取次數為1-7次。
6.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的除去殘留有機溶劑的方法為減壓蒸餾、蒸餾、精餾中的一種或多種。
7.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述的固定化節桿菌為固定化簡單節桿菌、固定化球形節桿菌。
8.根據權利要求1所述的醋酸可的松轉化中固定化細胞和環糊精循環利用的方法，其特征在于:所述環糊精的測定方法為采用Phenomenex Luna NH2IOOA (4.6mmX 250mm, 5 μ m)色譜柱，流動相為乙腈-水=60:40 (v/v),流速1.0mL/min, RID示差折光檢測器，進樣量20 μ L,柱溫 30°C。
【文檔編號】C12P33/02GK103695520SQ201310665015
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】申雁冰, 王敏, 王芳, 梁靜婷, 駱健美, 鄭宇
申請人:天津科技大學