利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌，所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ?ID?NO.14所示。本發明采用進化工程與全基因組測序結合的方法，發現了有利于枯草芽孢桿菌利用木糖生長的基因突變，通過基因工程技術將點突變引入野生菌株，獲得了能夠利用木糖快速生長的重組枯草芽孢桿菌。
【專利說明】利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及三種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]木質纖維素作為自然界廣泛存在的可再生生物質資源，具有廣闊的應用前景。而木糖是木質纖維素水解液中含量第二位的糖類，僅次于葡萄糖。因此有效地利用木糖是如何更好地高效地利用木質纖維素的關鍵因素之一。但目前已知的微生物中僅有少數具有很好的利用木糖的能力，包括枯草芽孢桿菌在內的眾多重要工業微生物都不具有良好的木糖利用能力，甚至完全無法利用木糖。
[0003]目前關于枯草芽孢桿菌利用木糖的研究都基于傳統的基因工程手段，通過敲除基因、更換基因啟動子和過表達相應的基因等手段都能使得枯草芽孢桿菌獲得利用木糖生長的能力，但這些通過傳統方法所獲得的工程菌株在含木糖的培養基中的生長能力和木糖消耗能力都較低。
[0004]而進化工程手段被廣泛地用于底物利用改善等方面，通過微生物自身的進化突變，更直接地獲得具有優良生長性狀的菌株。但進化過程具有不確定性，伴隨著有利突變產生的同時，一些無關的突變也可能產生，這些突變會造成菌株的基因組背景不明確，影響后續的基因工程操作，而有些突變甚至可能對菌株的某些特性產生負面的效果，限制了菌株今后的應用前景。因此無論通過基因工程手段還是進化工程方法改良菌株都具有明顯的不足之處。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿`菌。
[0006]本發明的第二個目的是提供第二種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌。
[0007]本發明的第三個目的是提供第三種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌。
[0008]本發明的技術方案概述如下:
[0009]一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示。
[0010]一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ IDN0.15所示。
[0011]—種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ IDN0.15所示，所述桿菌的comP基因第1121位T堿基缺失，堿基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16 所示。
[0012]本發明的優點:本發明采用進化工程與全基因組測序結合的方法，發現了三個有利于枯草芽孢桿菌利用木糖生長的基因突變，通過基因工程技術將點突變引入野生菌株，獲得了能夠利用木糖快速生長的重組枯草芽孢桿菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為菌株168AR有氧條件下發酵的生長曲線。
[0014]圖2為菌株168ARSR有氧條件下發酵的生長曲線。
[0015]圖3為菌株168ARSRCP有氧條件下發酵的生長曲線。
【具體實施方式】
[0016]下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明，下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但不對本發明作任何限制。
[0017]本發明為三種可以利用木糖生長的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分別命名為 168AR、168ARSR、168ARSRCP。
[0018]實施例1
[0019]通過進化工程獲得可以利用木糖生長的枯草芽孢桿菌。
[0020]通過將枯草芽孢桿菌168 (源自BGSC，BGSC編號1A1，常用的革蘭氏陽性菌生理研究模式菌株)在以木糖為碳源的基本鹽培養基中連續傳代培養，提高枯草芽孢桿菌利用木糖的生長能力。
[0021]具體操作如下:將枯草芽孢桿菌168先在額外添加葡萄糖至終濃度為lg/L的以木糖為碳源的基本鹽培養基中培養，培養條件為37°C，220rpm,待菌體0D_約為2時轉接至以木糖為碳源的基本鹽培養基中培養，之后在菌體生長至0D_至2左右時在木糖為碳源的基本鹽培養基中進行連續轉接培養，轉接72次后，分離到能在以木糖為碳源的基本鹽培養基中以比生長速率0.4511-1生長的菌株，命名為E72。
[0022]以木糖為碳源的基本鹽培養基的配方為:Na2HP046.8g/L, KH2P043.0g/L, NaCl0.5g/L, NH4Cll.0g/L, MgSO4.7H20246mg/L, CaCl216.6mg/L, FeCl2.6H2013.5mg/L, MnCl2.4H201.0mg/L, ZnCl2L 7mg/L, CuCl2.2H200.43mg/L, CoCl2.6H200.6mg/L, Na2MoO4.2H200.6mg/L,色氨酸 50mg/L,木糖 9g/L。
[0023]實施例2
[0024]將實施例1中所述枯草芽孢桿菌168及E72菌株委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行全基因組測序，通過比對兩菌株全基因組序列，發現E72菌株的araR基因第184位A堿基被G堿基替換、sinR基因第319位T堿基被C堿基替換及comP基因在1121位T堿基缺失。
[0025]實施例3
[0026]為了能夠將突變引入野生枯草芽孢桿菌168，需要使用不留抗生素標記的重組方案，采用參考文獻I中所述方案。該方案中所需要的upp基因敲除菌株可以通過參考文獻I中所述方式或其他 方式構建，本實施例中枯草芽孢桿菌168的upp基因敲除菌株構建過程如下:[0027]以pUC18質粒(購自Thermo公司)為載體,將upp基因上游同源臂、來源于pUBllO質粒(源于BGSC，為BGSC編號1E6菌株所含質粒)的卡那霉素抗性基因neo以及upp基因下游同源臂按上述順序組裝在一起，最終得到用于upp基因敲除的質粒pUCMupp,將pUCMupp質粒轉化入枯草芽孢桿菌168中，使用卡那霉素篩選，經PCR驗證得到upp基因敲除的出發菌株 168 Δ upp。
[0028]實施例4
[0029]將實施例2中所述的E72菌株中araR基因的突變序列引入實施例3所述的168 Aupp菌株。所獲得168AR菌株構建過程如下:
[0030]利用擴增引物Pcul/Pcu2以質粒pHP13(源自BGSC，為BGSC編號1E50菌株所含質粒)為模板擴增含有pBMlori及氯霉素抗性基因cat的DNA片段，利用引物Pcu3/Pcu4以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，擴增upp基因及其啟動子區，將上述2個DNA片段以XhoI/SalI及BamHI/Bglll位點連接并通過大腸桿菌DH5 α (購自Invitrogen公司)克隆,得到質粒ρ9⑶。
[0031]利用擴增引物ParaRl/ParaR2以Ε72基因組為模板，擴增含有araR基因第184位A堿基被G堿基替換突變的DNA片段，在SmaI位點克隆到質粒pUC18 (購自Thermo公司)中得到質粒pUCaraR。
[0032]利用擴增引物Pcu3/Pcu5以質粒p9CU為模板，擴增含有cat及upp基因的DNA片段,在AfeI位點克隆到質粒pUCaraR中，得到質粒pMaraR。
[0033]利用擴增引物ParaRl/ParaR2以pMaraR為模板進行擴增，所獲得的片段轉化入枯草芽孢桿菌168 Aupp，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并通過PCR驗證，獲得菌株168 ΔuppΔaraR。
`[0034]利用擴增引物ParaR3/ParaR4以E72基因組為模板，擴增含有araR基因第184位A堿基被G堿基替換的DNA片段，所獲得的片段轉化入枯草芽孢桿菌168 Δ upp Δ araR,用5-氟尿嘧啶篩選重組成功的陽性克隆，并通過DNA測序驗證，獲得菌株168AR，該菌株便是桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ IDN0.14所示的菌株。
[0035]將168AR菌株在以木糖為碳源的基本鹽培養基中進行有氧搖瓶發酵，發酵液裝液量為500ml規格的錐形瓶中含有50ml發酵液，培養條件為37°C，220rpm，結果如圖1所示。
[0036]168AR菌株獲得以木糖為碳源生長的能力，在有氧搖瓶發酵條件下其最大比生長速率為0.28h'因突變的序列公開，他人可以通過其他的方式構建本實施例中所構建的菌株，本實施例構建的168AR菌株僅為驗證araR基因第184位A堿基被G堿基替換可以使168 Aupp菌株獲得以木糖為碳源生長的能力。
[0037]實施例5
[0038]將實施例2中所述的E72菌株中sinR基因的突變引入實施例4中所述的168AR菌株，所獲得168ARSR菌株構建過程如下:
[0039]利用擴增引物PsinRl/PsinR2以E72菌株基因組為模板，擴增含有sinR基因第319位T堿基被C堿基替換的DNA片段，在SmaI位點克隆到實施例4中所述的質粒p9CU中得到質粒p9QJ-sinR。
[0040]將質粒p9⑶-sinR轉化入168AR菌株，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，接入LB培養基中37°C 220rpm培養至0D600=2時，取5ul菌液涂布于含有5-氟尿嘧啶的平板37°C培養16小時篩選第二次重組成功的克隆，經PCR及DNA測序驗證，獲得菌株168ARSR，該菌株便是桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示的菌株。
[0041]將168ARSR菌株在以木糖為碳源的基本鹽培養基中進行有氧搖瓶發酵，發酵液裝液量為500ml規格的錐形瓶中含有50ml發酵液，培養條件為37°C，220rpm，結果如圖2所示。
[0042]168ARSR菌株在以木糖為碳源的基本鹽培養基中有氧搖瓶發酵比生長速率較168AR得到提高。因突變的序列公開，他人可以通過其他的方式構建本實施例中所構建的菌株，本實施例構建的168ARSR菌株僅為驗證araR基因第184位A堿基被G堿基替換與sinR基因第319位T堿基被C堿基替換可以使168 Aupp菌株獲得以木糖為碳源生長的能力，在有氧搖瓶發酵條件下其最大比生長速率為0.44h-1，最大菌體濃度為0D600=5.5。
[0043]實施例6
[0044]將實施例2中所述的E72菌株中comP基因的突變序列引入實施例5中所述的168ARSR菌株，所獲得168ARSRCP菌株構建過程如下:
[0045]利用擴增引物PCOmPl/PCOmP2以E72菌株基因組為模板，擴增含有comP基因第1121位T堿基缺失的DNA片段，在SmaI位點克隆到實施例4中所述的質粒p9CU中得到質粒 p9CU_comP。
[0046]將質粒p9⑶-comP轉化入168ARSR菌株，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，接入LB培養基中37°C 220rpm培養至0D600=2時，取5ul菌液涂布于含有5-氟尿嘧啶的平板37°C培養16小時篩選第二次重組成功的克隆，經PCR及DNA測序驗證，獲得168ARSRCP菌株，該菌株便是桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ IDN0.14所示，桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所不，桿囷的comP基因第1121位T喊基缺失，喊基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16所示的菌株。
[0047]將168ARSRCP菌株在以木糖為碳源的基本鹽培養基中進行有氧搖瓶發酵，發酵液裝液量為500ml規格的錐形瓶中含有50ml發酵液，培養條件為37°C，220rpm，結果如圖3所示。
[0048]168ARSRCP菌株在以木糖為碳源的基本鹽培養基中有氧搖瓶發酵能獲得較168ARSR更高的最大菌體濃度。因突變的序列公開，他人可以通過其他的方式構建本實施例中所構建的菌株，本實施例構建的168ARSRCP菌株僅為驗證araR基因第184位A堿基被G堿基替換、sinR基因第319位T堿基被C堿基替換及comP基因第1121位T堿基缺失可以使168AUPP菌株獲得以木糖為碳源生長的能力，在有氧搖瓶發酵條件下其比生長速率為
0.44h-1，最大菌體濃度為0D600=6.4。
[0049]表1菌株構建所用引物序列
[0050]
【權利要求】
1.一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌，其特征是所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示。
2.一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌，其特征是所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示。
3.一種利用木糖生長的重組枯草芽孢桿菌，其特征是所述桿菌的araR基因第184位A堿基被G堿基替換，堿基替換后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述桿菌的sinR基因第319位T堿基被C堿基替換，堿基替換后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示，所述桿菌的comP基因第1121位T堿基缺失，堿基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16所示。
【文檔編號】C12R1/125GK103627663SQ201310664891
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】陳濤, 章博, 王智文, 趙學明 申請人:天津大學