一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成s-構型芳香醇的方法
【專利摘要】一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，屬于生物催化方法制備光學活性醇的【技術領域】。本發明采用在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮的生物轉化體系中按摩爾比例添加一定量的金屬離子，激活酵母細胞內氧化還原酶活性，一定程度上提高了底物的轉化率且幾乎不影響底物的立體選擇性。利用本發明在底物濃度為15mmol/L時，表面活性劑用量按不同的摩爾比加入，此時底物芳香酮的轉化率為55.8％～92.5％，產物S-構型芳香醇的對映體過量值為84.7％～98.8％，具有較高的實際應用價值。
【專利說明】一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法
【技術領域】
[0001]一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，屬于生物催化方法制備光學活性醇的【技術領域】。
【背景技術】 [0002]具有光學活性的手性芳香醇是許多手性藥物(如R-托莫西汀、S-心得安、S-舒喘寧、S-氟西汀等)合成的關鍵手性砌塊，不對稱還原前手性芳香酮是合成此類手性芳香醇的重要方法。目前合成該手性芳香醇的方法主要有化學法和生物法，化學法雖然可以獲得較高的產率，但存在反應立體選擇性偏低和手性催化劑制備比較困難的問題，生物法因具有高效專一和綠色節能的特點在催化此類反應中有很好的前景。生物法催化芳香酮不對稱還原主要包括氧化還原酶催化和整細胞催化，酵母細胞中含有豐富的氧化還原酶和輔酶，直接使用酵母細胞進行反應有利于還原過程中實現輔酶原位再生，同時也省略了酶的分離純化。
[0003]酵母細胞在芳香酮不對稱還原反應中的應用已有研究報道。但存在一個普遍的問題就是當反應溫度稍高時，會降低酵母細胞內氧化還原酶活性及破壞氧化還原酶與底物的結合，導致底物轉化率和產物ee值降低。Xiang Liu等(Chin.Chem.Lett.，2008，22:346~350)報道的用酵母細胞可不對稱還原對氯苯乙酮生成相應的S-構型芳香醇，結果表明當反應溫度為33°C時，底物對氯苯乙酮轉化率和產物S-1-4’ -氯苯基乙醇的ee值僅分別為35.4^^75.8?^ Zhong-Hua Yang 等(Fine Chemicals, 2007, 24:63 ~66)報道的用酵母細胞不對稱還原對氯苯乙酮的反應溫度為35°C時，產率僅為22%。因此在反應體系中加入一定量的能激活酵母細胞內氧化還原酶活性的添加劑，應能顯著提高底物的轉化率和穩定產物ee值。
[0004]有些金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的催化功能的發揮有重要的作用。金屬離子與酶催化功能的關系有如下幾個方面:(I)金屬離子在酶和底物之間起了橋梁作用，形成酶一金屬離子一底物三元復合物，使底物趨近酶分子，更有利于底物和酶活性中心部位的結合，加速反應的進行；(2)金屬離子具有親電性質，可以促使酶與底物之間的親電攻擊，加速反應的進行；(3)金屬離子具有穩定酶分子空間構象的作用，使酶保持其穩定的催化功能；(4)金屬離子可以作為電子傳遞體，參與酶催化的氧化還原反應。因此，金屬離子介入酵母細胞催化不對稱還原芳香酮不對稱合成手性中間體S-構型芳香醇將是一全新的合成方法，可適度解決反應中底物轉化率和產物ee值均低的問題。
【發明內容】
[0005]本發明的目的:提供一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱還原芳香酮合成S-構型芳香醇的方法，利用金屬離子的特殊作用，將金屬離子化合物添加到酵母細胞不對稱還原芳香酮的生物轉化體系中，通過添加不同類型的金屬離子，并調控金屬離子的加入量，以有效提高底物芳香酮的轉化率和產物S-構型芳香醇的對映體過量值。
[0006]本發明的技術方案:一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，其特征是在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮合成的體系中加入適量金屬離子，金屬離子化合物可選擇ZnCl2、MgCl2.6H20、CuCl2.2H20和MnCl2.6H20之一，步驟為:
[0007](I)酵母細胞活化:將7.5g活性干面包酵母加入到200mL的酵母活化液中，在活化溫度為30°C、振蕩速度為180r/min條件下活化lh，活化的菌體通過離心收集(lOmin，6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到活化的濕酵母待用；
[0008]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH48042.0g/L KH2PO4L Og/L
[0009]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0010](2)不對稱還原過程:在反應介質為30mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol/L, pH=7.0)中，依次加入金屬離子化合物、活化的濕酵母和底物芳香酮，使底物芳香酮濃度為15mmol/L,活化的濕酵母質量為5g,金屬離子濃度為3mmol/L~15mmol/L,在反應溫度為33°C、振蕩速度為180r/min下反應16h ；
[0011](3)分離檢測:反應結束后用乙酸乙酯萃取分離反應物，用裝有手性毛細管柱的氣相色譜儀分析檢測所得S-構型芳香醇，計算出底物轉化率和產物的對映體過量值。
[0012]本發明的有益效果:本發明將金屬離子添加到酵母細胞催化不對稱還原芳香酮制備S-構型芳香醇的生物轉化體系中，利用金屬離子可激活酵母細胞內氧化還原酶活性，來提高酵母細胞催化效率，進而提高底物芳香酮的轉化率和穩定產物S-構型芳香醇的對映體過量值。所用底物芳香酮為對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、對甲氧基苯乙酮、對硝基苯乙酮。利用本發明在底物濃度為15mmol/L時，金屬離子用量按不同摩爾比加入，此時底物芳香酮的轉化率為55.8 %~92.5 %，產物S-構型芳香醇的對映體過量值為84.7%~98.8 %，具有較高的實際應用價值。
【具體實施方式】
[0013]下面實施例可以使本領域技術人員全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0014]實施例1:
[0015]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在3(TC、180r/min條件下活化Ih,活化的菌體通過離心收集(lOmin, 6000r/min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0016]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/L
[0017]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0018]在250mL錐形瓶中加入9mmoL/L的ZnCl2,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為90.4%和 87.8%o
[0019]實施例2:
[0020]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0021]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og/L
[0022]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0023]在250mL錐形瓶中加入9mmoL/L的MgCl2.6H2O,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對硝基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosi1-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對硝基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -硝基苯基乙醇的對映體過量值分別為92.5%和 85.5%。
[0024]實施例3:
[0025]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0026]活化液的組成為:葡萄糖50g`/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/L
[0027]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0028]在250mL錐形瓶中加入9mmoL/L的CuCl2.2H20,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對甲基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosi1-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲基苯基乙醇的對映體過量值分別為80.5%和 89.4%。
[0029]實施例4:
[0030]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0031]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/L
[0032]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0033]在250mL錐形瓶中加入9mmoL/L的MnCl2.6H2O,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對甲氧基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應20h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲氧基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲氧基苯基乙醇的對映體過量值分別為65.3%和98.5%。
[0034]實施例5:
[0035]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在3(TC、180r/min條件下活化Ih,活化的菌體通過離心收集(lOmin, 6000r/min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0036]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og/L
[0037]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0038]在250mL錐形瓶中加入6mmoL/L的ZnCl2,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為87.5%和 88.2%。
[0039]實施例6:
[0040]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0041]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/L
[0042]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0043]在250mL錐形瓶中加入12mmoL/L的MgCl2.6H2O,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對硝基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosi1-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對硝基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -硝基苯基乙醇的對映體過量值分別為90.8%和 84.7%o
[0044]實施例7:
[0045]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0046]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH48042.0g/L KH2PO4L 0g/L[0047]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L[0048]在250mL錐形瓶中加入15mmoL/L的CuCl2.2H20,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對甲基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應16h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosi1-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲基苯基乙醇的對映體過量值分別為75.8%和 89.7%。
[0049]實施例8:
[0050]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r/min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(lOmin,6000r/min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0051]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og/L
[0052]CaSO4L Og/L 檸檬酸 1.0g/L
[0053]在250mL錐形瓶中加入3mmoL/L的MnCl2.6H2O,取5g活化的濕酵母溶于30mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol/L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入15mmol/L對甲氧基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在33°C和180r/min條件下反應20h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲氧基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲氧基苯基乙醇的對映體過量值分別為55.8%和98.8%。
【權利要求】
1.一種金屬離子介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，其特征是在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮體系中加入適量無機金屬離子化合物以合成S-構型芳香醇，步驟如下: (1)酵母細胞活化:將7.5g活性干面包酵母加入到200mL的酵母活化液中，在活化溫度為30°C、振蕩速度為180r/min條件下活化lh，活化的菌體通過離心收集，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol/L, pH = 7.0)洗滌兩次，得到活化的濕酵母待用；其中酵母活化液的組成為:葡萄糖50g/L、NH4S042.0g/L、KH2PO4L Og/L、CaSO4L Og/L、檸檬酸1.0g/L ；
(2)不對稱還原過程:在反應介質為30mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol/L，pH = 7.0)中，依次加入金屬離子化合物、活化的濕酵母和底物芳香酮，使底物芳香酮濃度為15mmol/L,活化的濕酵母質量為5g,金屬離子濃度為3mmol/L~15mmol/L,然后在反應溫度為33°C、振蕩速度為180r/min下反應16h ； (3)分離檢測:反應結束后用乙酸乙酯萃取分離反應物，用裝有手性毛細管柱的氣相色譜儀分析檢測所得S-構型芳香醇，計算出底物轉化率和產物的對映體過量值。
2.根據權利要求1所述方法，其特征是底物芳香酮為對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、對甲氧基苯乙酮、對硝基苯乙酮，產物S-構型芳香醇為S-1-4’ -氯苯基乙醇、S-1-4’ -甲基苯乙醇、S-1-4’ -甲氧基苯基乙醇、S-1-4’ -硝基苯乙醇。
3.根據權利要求1所述方法，其特征是金屬離子化合物為ZnCl2、MgCl2.6H20、CuCl2.2H20、MnCl2.6H20 其中之一。
【文檔編號】C12P7/22GK103642848SQ201310664295
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】劉湘, 楊芬, 檀夢婷 申請人:江南大學