一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成s-構型芳香醇的方法

一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成s-構型芳香醇的方法
【專利摘要】一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，屬于生物催化方法制備光學活性醇的【技術領域】。本發明采用在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮的生物轉化體系中按質量比例添加一定量的表面活性劑，促使底物和產物在水相中增溶及改善細胞膜透性，明顯提高了底物的轉化率且幾乎不影響底物的立體選擇性。利用本發明在底物濃度為40mmol／L時，表面活性劑用量按不同的質量比加入，此時底物芳香酮的轉化率為57.5％～98.0％，產物S-構型芳香醇的對映體過量值為85.7％～98.1％，具有較高的實際應用價值。
【專利說明】一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法
【技術領域】
[0001]一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，屬于生物催化方法制備光學活性醇的【技術領域】。
【背景技術】 [0002]具有光學活性的手性芳香醇是許多手性藥物(如R-托莫西汀、S-心得安、S-舒喘寧、S-氟西汀等)合成的關鍵手性砌塊，不對稱還原前手性芳香酮是合成此類手性芳香醇的重要方法。目前合成該手性芳香醇的方法主要有化學法和生物法，化學法雖然可以獲得較高的產率，但存在反應立體選擇性偏低和手性催化劑制備比較困難的問題，生物法因具有高效專一和綠色節能的特點在催化此類反應中有很好的前景。生物法催化芳香酮不對稱還原主要包括氧化還原酶催化和整細胞催化，酵母細胞中含有豐富的氧化還原酶和輔酶，直接使用酵母細胞進行反應有利于還原過程中實現輔酶原位再生，同時也省略了酶的分離純化。
[0003]酵母細胞在芳香酮不對稱還原反應中的應用已有研究報道。但存在一個普遍的問題就是當底物濃度稍高時，反應過程中親脂性細胞膜吸附的疏水性底物和產物易造成細胞內底物和產物抑制效應，導致底物轉化率降低。Xiang Liu等(Chin.Chem.Lett.，2008，22:346~350)報道的用酵母細胞可不對稱還原對甲基苯乙酮和對氯苯乙酮生成相應的S-構型芳香醇,結果表明當底物對甲基苯乙酮和對氯苯乙酮濃度均為50mmol / L時,二者的轉化率僅分別為 62.9%和 35.4%。Zhong-Hua Yang 等(Fine Chemicals，2007，24:63 ~66)報道的用酵母細胞不對稱還原對氯苯乙酮的濃度只有15mmol / L時，產率僅為10%~35%。因此在反應體系中加入一定量的能降低底物和產物抑制效應的添加劑，應能顯著提高底物的轉化率。
[0004]表面活性劑可使疏水性底物和產物在細胞外的水相中增溶，減少底物和產物在細胞膜表面的局部富集，有助于降低細胞內過高的底物和產物濃度，而且不同類型的表面活性劑對有機物的增溶能力不同，其中非離子表面活性劑的增溶作用最強；另一方面適量表面活性劑可與細胞膜形成混合膠束，使細胞膜的結構和滲透性發生變化，強化底物和產物的跨膜運輸，避免出現產物抑制作用，有利于反應快速進行，進而使反應轉化率提高。因此，表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱還原芳香酮不對稱合成手性中間體S-構型芳香醇將是一全新的合成方法，可適度解決反應中底物轉化率低的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的:提供一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱還原芳香酮合成S-構型芳香醇的方法，利用表面活性劑的特殊作用，將表面活性劑添加到酵母細胞不對稱還原芳香酮的生物轉化體系中，通過添加不同類型的表面活性劑，并調控表面活性劑的加入量，以有效提高底物芳香酮的轉化率和產物S-構型芳香醇的對映體過量值。[0006]本發明的技術方案:一種表面活性劑介入酵母細胞催化不對稱合成S-構型芳香醇的方法，其特征是在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮合成S-構型芳香醇的體系中加入適量表面活性劑，表面活性劑可選擇十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethyl ammoniumbromide,簡寫CTAB)、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,簡寫SDS)、壬基酌.聚氧乙烯醚(Nonylphenol polyoxyethylene ether,簡寫 NP)系列 NP_4、NP_6 和 NP-8 之一，步驟為:
[0007](I)酵母細胞活化:將7.5g活性干面包酵母加入到200mL的酵母活化液中，在活化溫度為30°C、振蕩速度為180r / min條件下活化lh，活化的菌體通過離心收集(lOmin，6000r / min)，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到活化的濕酵母待用；
[0008]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/LCaS04l.0g/L 檸檬酸 l.0g / L
[0009](2)不對稱還原過程:在反應介質為40mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中，依次加入表面活性劑、活化的濕酵母和底物芳香酮，使底物芳香酮濃度為40mmol / L，活化的濕酵母質量為4g，表面活性劑濃度為0.25g/L~1.25g/L，在反應溫度為30°C、振蕩速度為180r / min下反應20h ；
[0010](3)分離檢測:反應結束后用乙酸乙酯萃取分離反應物，用裝有手性毛細管柱的氣相色譜儀分析檢測所得S-構型芳香醇，計算出底物轉化率和產物的對映體過量值。
[0011]本發明的有益效果:本發明將表面活性劑添加到酵母細胞催化不對稱還原芳香酮制備S-構型芳香醇的生物轉化體系中，利用表面活性劑可促使底物和產物在水相中增溶及改善細胞膜透性，來提高酵母細胞催化效率，且不影響對底物的立體選擇性，進而提高底物芳香酮的轉化率和幾乎不影響產物S-構型芳香醇的對映體過量值。所用底物芳香酮為鄰氯苯乙酮、間氯苯乙酮、對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、對甲氧基苯乙酮、對硝基苯乙酮。利用本發明在底物濃度為40mmol / L時，表面活性劑用量按不同質量比加入，此時底物芳香酮的轉化率為57.5%~98.0%，產物S-構型芳香醇的對映體過量值為85.7%~98.1 %，具有較高的實際應用價值。
【具體實施方式】
[0012]下面實施例可以使本領域技術人員全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0013]實施例1:
[0014]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh,活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0015]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/LCaS04l.0g / L 檸檬酸 1.0g/L
[0016]在250mL錐形瓶中加入0.25g/L的NP_4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為94.4%和 93.8%o
[0017]實施例2:
[0018]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0019]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g / L KH2PO4L Og / LCaSO4L Og/L 檸檬酸1.0g/L
[0020]在250mL錐形瓶中加入0.50g/L的NP-4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對硝基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對硝基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -硝基苯基乙醇的對映體過量值分別為 98.0%和 88.0%。[0021]實施例3:
[0022]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0023]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L 0g/L 檸檬酸1.0g/L
[0024]在250mL錐形瓶中加入0.50g / L的NP-4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對甲基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲基苯基乙醇的對映體過量值分別為 90.0%和 96.0%o
[0025]實施例4:
[0026]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0027]活化液的組成為:葡萄糖50g / L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L 0g/L 檸檬酸1.0g/L
[0028]在250mL錐形瓶中加入1.25g/L的NP_4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對甲氧基苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h.反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosi1-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對甲氧基苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -甲氧基苯基乙醇的對映體過量值分別為57.5%和97.2%。
[0029]實施例5:
[0030]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0031]活化液的組成為:葡萄糖50g / L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L Og / L 檸檬酸l.0g / L
[0032]在250mL錐形瓶中加入1.0g/L的NP-4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L間氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物間氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-3’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為91.4%和 92.3%。
[0033]實施例6:
[0034]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh。活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0035]活化液的組成為:葡萄糖50g / L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L Og / L 檸檬酸1.0g/L
[0036]在250mL錐形瓶中加入0.75g/L的NP-4，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L鄰氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物鄰氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-2’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為88.0%和 98.1%ο
[0037]實施例7:
[0038]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh,活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0039]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/LCaS04l.0g/L 檸檬酸
1.0g/L
[0040]在250mL錐形瓶中加入0.25g / L的CTAB，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2P04-K2HP04緩沖液(0.5mol / L, pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’ -氯苯基乙醇的對映體過量值分別為87.6%和92.0%。
[0041]實施例8:
[0042]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh,活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0043]活化液的組成 為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L 0g/L 檸檬酸 1.0g/L
[0044]在250mL錐形瓶中加入0.25g/L的SDS，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為91.5%和 85.7%。
[0045]實施例9:
[0046]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh,活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0047]活化液的組成為:葡萄糖50g/L NH4S042.0g/L KH2PO4L Og / LCaSO4L 0g/L 檸檬酸 1.0g/L
[0048]在250mL錐形瓶中加入0.50g/L的NP_6，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為94.0%和 93.3%。[0049]實施例10:
[0050]將7.5g活性干面包酵母和200mL的酵母活化液加入錐形瓶中，置于水浴恒溫振蕩儀上在30°C、180r / min條件下活化lh,活化的菌體通過離心收集(10min,6000r / min),離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到的菌體
立即用于下一步酵母不對稱還原芳香酮反應。
[0051]活化液的組成為:葡萄糖50g / L NH4S042.0g/L KH2PO4L 0g/LCaS04l.0g/L 檸檬酸 l.0g / L
[0052]在250mL錐形瓶中加入0.50g/L的NP_8，取4g活化的濕酵母溶于40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH = 7.0)中并加入到錐形瓶中，最后加入40mmol / L對氯苯乙酮，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩儀中在30°C和180r / min條件下反應20h。反應結束后，離心分離反應液，取上清液用乙酸乙酯(15mLX2)萃取，萃取液經離心、干燥、濃縮后加入一定量的內標物十三烷后，再用裝有CP-Chirosil-DexCB手性毛細管柱的氣相色譜儀檢測，底物對氯苯乙酮的轉化率和產物S-1-4’-氯苯基乙醇的對映體過量值分別為92.6%和 94.0%o·
【權利要求】
1.一種表面活性劑介入酵母細胞催化合成S-構型芳香醇的方法，其特征是在酵母細胞催化不對稱還原芳香酮體系中加入適量表面活性劑以合成S-構型芳香醇，步驟如下: (1)酵母細胞活化:將7.5g活性干面包酵母加入到200mL的酵母活化液中，在活化溫度為30°C、振蕩速度為180r / min條件下活化lh，活化的菌體通過離心收集，離心后的菌體再用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mmol / L，pH = 7.0)洗滌兩次，得到活化的濕酵母待用；其中酵母活化液的組成為:葡萄糖50g / L、NH4S042.0g / UKH2PO4L 0g/L、CaS04l.0g/L、檸檬酸 l.0g / L ； (2)不對稱還原過程:在反應介質為40mLKH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.5mol / L，pH= 7.0)中，依次加入表面活性劑、活化的濕酵母和底物芳香酮，使底物芳香酮濃度為40mmol / L，活化的濕酵母質量為4g，表面活性劑濃度為0.25g/L~1.25g / L，然后在反應溫度為30°C、振蕩速度為180r / min下反應20h ； (3)分離檢測:反應結束后用乙酸乙酯萃取分離反應物，用裝有手性毛細管柱的氣相色譜儀分析檢測所得S-構型芳香醇，計算出底物轉化率和產物的對映體過量值。
2.根據權利要求1所述方法，其特征是底物芳香酮為鄰氯苯乙酮、間氯苯乙酮、對氯苯乙酮、對甲基苯乙酮、對甲氧基苯乙酮、對硝基苯乙酮，產物S-構型芳香醇為S-1-2’ -氯苯基乙醇、S-1-3’ -氯苯基乙醇、S-1-4’ -氯苯基乙醇、S-1-4’ -甲基苯乙醇、S-1-4’ -甲氧基苯基乙醇、S-1-4’ -硝基苯乙醇。
3.根據權利要求1所述方法，其特征是表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、壬基 酚四聚氧乙烯醚、壬基酚六聚氧乙烯醚和壬基酚八聚氧乙烯醚其中之一。
【文檔編號】C12P7/22GK103667368SQ201310664293
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】劉湘, 楊芬, 梁敏婷 申請人:江南大學