鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系及其建立方法和應用的制作方法

鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系及其建立方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種對鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系及其建立方法和應用。該細胞系保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCCNO：C2013179。該異育銀鯽腦組織細胞系生長狀態良好，對目前難以用常見魚類細胞系培養的CyHV-2敏感；CyHV-2在GiCB細胞上連續傳代至第6代仍可檢測到病毒核酸且細胞病變穩定；將出現病變效應的細胞做超薄電鏡切片，可在GiCB細胞中觀察到大量CyHV-2成熟病毒粒子及其復制過程。本發明所構建的異育銀鯽腦組織細胞系的構建方法重復性強，條件科學合理，適用于體外培養鯉皰疹病毒Ⅱ型，為鯉皰疹病毒Ⅱ型的分離、檢測、培養及其完整的生物學特性研究提供了技術平臺。
【專利說明】鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系及其建立方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于水生生物細胞領域和水產養殖病害防控【技術領域】，具體涉及鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系，還涉及該細胞系的建立方法，還涉及該細胞系的應用。
【背景技術】
[0002]鯉皰疫病毒II型(Cyprinid herpesvirus II, CyHV-2)又被稱為皰疫病毒性造血器官壞死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV)或金魚造血器官壞死病毒(Goldf ish haematopoietic necrosis virus, GFHNV),與鯉科魚類的其他兩種皰疫病毒 CyHV-1 (Carp pox)和 CyHV-3 (Koi herpesvirus, KHV)同屬 Alloherpesviridae科，Cypriniviruse屬。CyHV-2于1995年首次被報道，1992~1993年間給日本西部養殖的金魚造成巨大的經濟損失，患病金魚死亡率高達100%。隨后其他國家和地區也相繼有了該病暴發的報道，1997年春季在美國西海岸一用循環水養殖的金魚幼魚出現大量死亡，死亡率高達80%以上，后經證實是由CyHV-2感染。觀賞魚的國際貿易很大程度上促進了該病的全球傳播，隨后我國臺灣、澳大利亞、英國養殖的金魚相繼暴發該病。2011年匈牙利報道了養殖的銀鯽也發現了 CyHV-2感染。2009年起，在我國鯽魚的主要養殖區江蘇省暴發了由CyHV-2引起的鯽魚造血器官壞死病，截至2012年6月中旬，江蘇省內射陽、大豐、鹽都、寶應、高郵、興化、洪澤、楚州等地病害發生面積超過10萬畝，發病塘口的死亡率高達90%，造成的經濟損失已達數億元。與此同時，在湖北、湖南、江西、黑龍江等省份，也相繼在患病鯽魚體內檢測出CyHV-2。該病毒傳染性強、致死率高，給鯽魚、金魚養殖業造成了重大的經濟損失，嚴重威脅鯽魚、金魚養殖業的發展。
[0003]細胞培養分離技術是最準確的病毒病診斷方法，通常是世界動物衛生組織(OIE)推薦的魚類病毒檢測的首選方法。但已有研究發現CyHV-2很難在魚類病毒分離常用的細胞系中進行增殖。胖頭鯉細胞(`fathead minnow cells, FHM)、鯉魚上皮瘤細胞(epithelioma popuasum cuprini, EPC)、獲鱺腎細胞(eel kidney, EK-1)、鮭魚胚胎細胞(chinook salmon embryo, CHSE-214)、虹蹲魚性腺細胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和羅非魚卵巢細胞(tilapia ovary，T0-2)均對CyHV-2不敏感，僅錦鯉鰭細胞(koi finl，KF-1)能產生細胞病變效應(CPE)，但病毒在KF-1細胞上傳至第3代后，CPE消失且檢測不到病毒核酸。由于缺乏CyHV-2敏感的細胞系，限制了對CyHV-2的研究，因此建立對CyHV-2敏感的細胞系并研究該細胞系的生物學特性，對CyHV-2進行連續傳代擴大培養從而深入研究病毒的特性，具有重要的意義。本發明建立了用于分離培養鯉皰疹病毒II型的敏感細胞系GiCB，該細胞系的應用還包括但不局限于:分子細胞水平上開展鯉皰疹病毒II型及其他魚類病毒理化特性、形態發生、病毒感染途徑、感染機理；制備、篩選或評價魚類抗病毒藥物。
【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系。該細胞系可用于分離，檢測，分離培養鯉皰疹病毒II型病毒。該細胞系已于2013年11月29日送往中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名:異育銀鯽腦組織細胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏編號:CCTCC NO:C2013179,地址:中國武漢武漢大學。
[0005]本發明的另一個目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系的建立方法，方法簡單，易行。
[0006]本發明最后一個目的在于提供了一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系的應用。該細胞系可以用于分離、檢測和培養鯉皰疹病毒II型；用于對CyHV-2進行體外連續傳代、擴大培養從而深入研究該病毒的特性。
[0007]為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施:
[0008]一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系的建立方法，步驟如下:
[0009](I)腦組織的處理:無菌條件下取出異育銀鯽腦組織，無菌處理為50~IOOmm3的組織塊；(2)原代培養:將步驟(1)中的組織塊放入組織分離專用胰蛋白酶消化液中消化10~15min，期間震蕩3~4次，加入等體積的異育銀鯽腦組織細胞專用培養液(以下簡稱為培養液)，吹打均勻，離心收集經消化處理的細胞，吸棄上清，添加培養液，吹打細胞沉淀，將制成的細胞懸液加入細胞培養瓶中培養，每2天半量更換培養液一次；
[0010](3)傳代培養:原代培養異育銀鯽腦組織細胞長成單層后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘， 用培養液懸起細胞，按I瓶傳2瓶的方式進行傳代培養。待細胞再次形成單層后，按照上述的細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養，得到來源于異育銀鯽腦組織的鯉皰疹病毒II型敏感細胞系GiCB，該細胞系已于2013年11月29日送往中國典型培養物保藏中心進行保藏，分類命名:異育銀鯽腦組織細胞系(Gibelcarp, Carassius auratus gibelio) GiCB,保藏編號:CCTCC NO:C2013179,地址:中國武漢武漢大學。
[0011]異育銀鯽腦組織細胞系GiCB，為成纖維細胞樣細胞，最佳培養基為M199，最適血清體積分數為20% (V/V)，最適培養溫度為25°C。GiCB細胞經液氮冷凍后復蘇，通過染色，約80%的細胞具有細胞活性，并保持原有生長狀態，該細胞已經穩定傳代65次。
[0012]所述的組織分離專用胰蛋白酶消化液為0.5%~0.7%W/V胰蛋白酶消化液，細胞培養、傳代的溫度為25~28°C，pH值7.0~7.4。
[0013]所述的異育銀鯽腦組織細胞專用培養液為含有10~20%V/V胎牛血清、10~20ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子、10~20ng/ml人表皮細胞生長因子、100U/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、0.25 u g/ml兩性霉素B，pH值7.0~7.4的M199培養液。
[0014]一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系的應用，包括該細胞系在鯉皰疹病毒II型培養上的應用；該細胞系在鯉皰疹病毒II型檢測上的應用；該細胞系在鯉皰疹病毒II型分離上的應用；該細胞系在制備鯉皰疹病毒II型病疫苗上的應用；該細胞系在其他魚類病毒分離檢測上的應用；該細胞系在作為抗鯉皰疹病毒II型藥物篩選生物模型上的應用；該細胞系在魚類細胞的基因轉染和研究基因功能上的應用。
[0015]所述的鯉皰疹病毒II型為鯉皰疹病毒II型野生毒株或已報道的鯉皰疹病毒II型分離株。
[0016]利用巢式PCR檢測方法，對在GiCB細胞上進行連續傳代的鯉皰疹病毒II型DNA檢測驗證，結果證實在GiCB細胞連續傳代第6代仍可檢測到病毒核酸；細胞病變效應(CPE)穩定且明顯；將出現病變效應的細胞做超薄電鏡切片觀察，透射電鏡結果顯示，在GiCB細胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其復制過程，證明CyHV-2在GiCB細胞中具有良好的生物學活性。
[0017]對送檢的CyHV-2疑似臨床病料，在巢式PCR檢測為陽性的基礎上，利用本發明所建立的GiCB細胞系接種疑似病料后，12d即可觀察到細胞空泡化、細胞相互融合、細胞單層脫落等細胞病變；對送檢的CyHV-2疑似臨床病料進行連續傳代超過5次，巢式PCR仍可檢測到該病毒的存在。
[0018]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0019](1)已有研究發現CyHV-2很難在魚類病毒分離常用的細胞系中進行增殖。胖頭鯉細胞(fathead minnow cells, FHM)、鯉魚上皮瘤細胞(epithelioma popuasumcuprini, EPC) > 獲鱺腎細胞(eel kidney, EK-1) > 鮭魚胚胎細胞(chinook salmonembryo, CHSE-214)、虹蹲魚性腺細胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和羅非魚卵巢細胞(tilapia ovary, T0-2)均對CyHV-2不敏感，僅錦鯉鰭細胞(koi finl, KF-1)能產生細胞病變效應(CPE)，但病毒在KF-1細胞上傳至第3代后，CPE消失且檢測不到病毒核酸。而本發明采用分離培養對CyHV-2易感的異育銀鯽的腦組織細胞，建立了對CyHV-2敏感的異育銀鯽腦組織細胞系；
[0020](2)本發明對在GiCB細胞上進行連續傳代的鯉皰疹病毒II型DNA檢測驗證，結果證實在GiCB細胞連續傳代第6代仍可檢測到病毒核酸；細胞病變效應(CPE)穩定且明顯；將出現病變效應的細胞做超薄電鏡切片觀察，透射電鏡結果顯示，在GiCB細胞中存在CyHV-2成熟病毒粒子及其復制過程，證明CyHV-2在GiCB細胞中具有良好的生物學活性。
[0021]本發明立足于鯉皰疹病毒II型的分離、檢測及培養，建立CyHV-2敏感細胞系GiCB，為CyHV-2的分離鑒定及其完整的生物學特性的研究提供了必要的技術平臺，為鯽魚、金魚造血器官壞死癥的防控奠定了重要的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為不同代次異育銀鯽腦組織細胞GiCB示意圖。
[0023]圖1中A為原代異育銀鯽腦組織細胞；圖1中B為第32代異育銀鯽腦組織細胞
系O
[0024]圖2為第6代異育銀鯽腦組織細胞系的染色體及其數目分布示意圖。
[0025]圖3為異育銀鯽腦組織細胞系感染CyHV-2后示意圖。
[0026]圖3中A為GiCB正常對照細胞；圖3中B為GiCB細胞感染CyHV_2第I代12d ；圖3中C為GiCB細胞感染CyHV-2第3代12d ;圖3中D為GiCB細胞感染CyHV-2第6代12d。
[0027]圖4為不同培養代次CyHV-2的巢式PCR檢測結果示意圖。
[0028]M:DL2000Marker ；Linel:CyHV-2 組織毒對照；Line2:第 I 代 GiCB 細胞培養CyHV-2細胞毒；Line3:第2代GiCB細胞培養CyHV-2細胞毒；Line4 --第3代GiCB細胞培養CyHV-2細胞毒；Line5:第4代GiCB細胞培養CyHV_2細胞毒；Line6:第5代GiCB細胞培養CyHV-2細胞毒；Line7:第6代GiCB細胞培養CyHV-2細胞毒；Line8:陰性對照
[0029]圖5為第5代CyHV-2細胞毒感染GiCB的細胞電鏡超薄切片示意圖。
【具體實施方式】
[0030]以下為結合具體實施例來進一步描述本發明，這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均應涵蓋在本發明的保護范圍之內，本發明實施例所用試劑，如未特別說明，均購自生化商店；所用實驗技術，如未特別說明，均為常規技術。
[0031]本發明具體實施例中涉及的材料及試劑:
[0032]I)實驗魚與毒株
[0033]異育銀鯽，體重約50g，體長約12cm，來源于中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣實驗基地。實驗前于室內暫養I周。鯉皰疹病毒II型由本實驗室分離保存。
[0034]2)主要試劑與耗材
[0035]M199細胞培養基、兩性霉素B、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、二甲基亞砜(DMS0)、秋水仙素均購自Sigma公司；人堿性成纖維細胞生長因子、人表皮細胞生長因子為P印rotech公司產品；胎牛血清購自GIBICO公司；DNAzol核酸提取試劑為Invitrogen產品；PCR用rTaq酶、dNTPs為TaKaRa公司產品。細胞培養瓶、移液管、細胞凍存管均購自Corning公司；制備透射電鏡超薄切片所需試劑及耗材均購自北京中興百瑞公司。
[0036]3)主要儀器設備`
[0037]II 級生物安全柜(ESCO);倒置顯微鏡(Nikon) ;CCD 相機(Nikon NIS ElementsF530);低速冷凍離心機(3K15，Sigma);恒溫培養箱(Sanyo, MIR-153);液氮罐(MVE);超薄切片機(UC7，Leica);透射電子顯微鏡(H-7650，Hitachi)
[0038]實施例1:
[0039]異育銀鯽腦組織細胞系的建立，其步驟如下:
[0040]( I)腦組織的處理:無菌條件下取出異育銀鯽腦組織置于培養皿中，PBS漂洗3次，用滅菌的眼科剪子剪成50~IOOmm3的組織塊；
[0041](2)原代培養:將剪碎的組織塊放入0.5ff/V%胰蛋白酶消化液中28°C消化15min，期間震蕩3次，消化結束后加入等體積的異育銀鯽腦組織細胞專用培養液(以下簡稱為培養液，培養液配方為含有20V/V%胎牛血清、10ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子、10ng/ml人表皮細胞生長因子、100U/ml青霉素、IOOii g/ml鏈霉素、0.25 u g/ml兩性霉素B的M199培養基)，吹打均勻后用100目尼龍紗網過濾一次，收集過濾液至離心管中，1500rpm離心5min收集經消化過濾處理的細胞，吸棄上清，再加入培養液吹打均勻后用300目尼龍紗網過濾一次，收集過濾液，1000rpm離心5min得到細胞沉淀；添加培養液，吹打細胞沉淀，將制成的細胞懸液加入25cm2細胞培養瓶中，25°C培養，每2天半量更換培養液一次；
[0042](3)傳代培養:原代培養異育銀鯽腦組織細胞長成單層后，吸棄原培養液，加入2ml0.25ff/V%的胰蛋白酶消化液室溫靜置消化2分鐘，吸棄胰蛋白酶消化液，加入IOml異育銀鯽腦組織細胞專用培養液，吹打瓶底細胞制成細胞懸液，按I瓶傳2瓶的方式進行傳代培養。待細胞再次形成單層后，按照上述的細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養，至細胞系建立。當傳代培養至第6代后，異育銀鯽腦組織細胞專用培養液中不再添加人堿性成纖維細胞生長因子、人表皮細胞生長因子、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B。傳代GiCB細胞約2天或3天即可鋪滿細胞培養瓶底部80%左右形成匯合細胞單層，5天可形成致密細胞單層，即可進行下次傳代培養。如圖1所示，A為原代異育銀鯽腦組織細胞；B為第32代異育銀鯽腦組織細胞系。
[0043]該細胞系已于2013年11月29日送至中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號:CCTCC N0.C2013179，分類命名:異育銀鯽腦組織細胞系GiCB，地址:中國武漢武漢大學。
[0044]實施例2:
[0045]異育銀鯽腦組織細胞系GiCB的生物學特性:
[0046](I)形態學:細胞類型為成纖維樣細胞。
[0047](2)生長特性:傳代的GiCB細胞30min后開始貼壁，8h后貼壁完全；群體倍增時間為 50.5h。
[0048](3)穩定性:異育銀鯽腦組織細胞系GiCB至申請日前已傳至65代，增殖穩定。
[0049](4)凍存與復蘇: [0050]GiCB細胞復蘇后貼壁快速，生長形態、狀況與沒有凍存的細胞基本相似，未出現明顯差別。復蘇細胞用臺盼藍染色，經細胞統計計數，約(80.38±5.10)%的細胞不著色，具有細胞活性。
[0051](5)染色體分析
[0052]第6代異育銀鯽腦組織細胞系GiCB處于對數生長期，加入終濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，25°C孵育4h后消化收集細胞，用0.075mol/L的KCl溶液低滲處理25min后加入預冷的卡諾固定液，1000rpm離心5min去上清后再用預冷的卡諾固定液固定3次,每次15min。冷滴片法滴片,干燥后用5%Giemsa染色25min,干燥后顯微鏡觀察。在觀察的100個分裂相細胞中，第6代異育銀鯽腦組織來源細胞的染色體眾數為212條(圖2)，與人工培育四倍體異育銀鯽(桂建芳等，異育銀鯽人工繁育群體中復合四倍體的發現及其育種潛力，科學通報，1992，07 =646-648 ;桂建芳等，人工復合四倍體異育銀鯽雌核發育生殖方式的初步證明，科學通報，1992，09:836-838)體染色體特征吻合，即銀鯽的全部染色體162條加鯉魚的一個染色體組(50條染色體)。
[0053]實施例3:
[0054]鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系的應用，其過程如下:
[0055]( I)感染鯉皰疹病毒II型病料的采集及處理
[0056]采集剛死亡的感染鯉皰疹病毒II型的病魚腎臟和脾臟，剪碎并加等體積PBS勻漿，6000rpm4 °C離心30min后經0.22 μ m濾膜過濾制備成無菌組織勻漿液，分裝后保存與-80°C備用；
[0057](2)鯉皰疹病毒II型在GiCB的增殖
[0058]GiCB培養至 細胞單層80%后，棄去培養基經PBS清洗2遍后，將上述處理過的病料組織勻衆液上清Iml接種于GiCB細胞單層,加入終濃度為10 μ g/ μ I聚凝胺(Polybrene),25°C吸附2h，期間每隔15~20min輕微晃動培養瓶一次以便均勻吸附。待吸附結束后，換血清濃度為2%的M199維持液繼續25°C培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，至病變達80%后收
獲病毒。
[0059](3 )鯉皰疹病毒II型細胞毒核酸的提取及巢式PCR檢測
[0060]將出現明顯病變的GiCB細胞反復凍融2次后經DNAzol提取病毒DNA。利用巢式PCR檢測CyHV-2的方法檢測該病毒。外引物Pl的PCR擴增，引物
[0061]CyHV-2PlF 為:TGAAATGTCAAAAGTGGATGG ；
[0062]CyHV-2PlR 為:TATTCCCAGACAGCCTTCAAA
[0063]取擴增條件為:94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30個循環后72 °C 5分鐘；內引物P2的PCR擴增，引物
[0064]CyHV-2P2F 為:GAACACCGCTGCTCATCATC
[0065]CyHV-2P2R 為:ACTCTTCGCAAGTCCTCACC
[0066]取Iy L外引物Pl的擴增產物作為模板，以內引物F 2為引物進行PCR擴增，反應條件與第一次擴增相同。同時取陽性對照DNA模板做陽性對照，取純水做陰性對照。擴增產物經2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0067](4)鯉皰疹病毒II型感染GiCB的電鏡觀察
[0068]將感染第5代CyHV-2細胞毒的GiCB細胞經2%戊二醛固定后，四氧化鋨再固定，再經脫水包埋后進行超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，透射電鏡觀察。
[0069](5)結果
[0070]鯉皰疹病毒II型病魚組織勻漿接種與GiCB細胞單層IOd后出現細胞變圓或空泡化、回縮、形成合胞體、細胞間隙變大；12d后GiCB細胞融合并形成多核巨細胞、細胞單層脫落產生拉網現象，出現典型的細胞病變效應(CPE)，并且傳代至第6代CPE穩定(圖3)，而正常的GiCB細胞未見任何變化。
[0071 ] 提取不同培養代數的CyHV-2細胞培養物DNA，進行巢式PCR檢測，經過兩輪PCR擴增得到357bp的片段，與陽性對照的擴增條帶大小一致(圖4)，結果均判定為陽性。
[0072] 通過透射電鏡觀察感染第5代CyHV-2細胞毒的GiCB細胞，可觀察到大量成熟的CyHV-2病毒粒子及其復制過程·，說明CyHV-2在GiCB細胞中具有良好的生物學活性(圖5)，進一步證明了本發明所建立的異育銀鯽腦組織細胞系對病毒的敏感性，可用于病毒的分離，培養及檢測。同時，可作為研究鯉皰疹病毒II型生物學特性的細胞模型，制備鯉皰疹病毒II型的疫苗及抗病毒藥物篩選。
【權利要求】
1.一種鯉皰疹病毒II型敏感的異育銀鯽腦組織細胞系，其特征在于:異育銀鯽腦組織細胞系(Gibel carp, Carassius auratus gibelio) GiCB, CCTCC NO:C2013179。
2.權利要求1所述細胞系的建立方法，具體步驟如下: (1)腦組織的處理:無菌條件下取出異育銀鯽腦組織，無菌處理為5(T100mm3的組織塊； (2)原代培養:將步驟(1)中的組織塊放入組織分離專用胰蛋白酶消化液中消化l(Tl5min，期間震蕩3~4次，加入等體積的異育銀鯽腦組織細胞專用培養液，吹打均勻，離心收集經消化處理的細胞，吸棄上清，添加培養液，吹打細胞沉淀，將制成的細胞懸液加入細胞培養瓶中培養，每2天半量更換培養液一次； (3)傳代培養:原代培養異育銀鯽腦組織細胞長成單層后，加入0.25%ff/V的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘，用培養液懸起細胞，按I瓶傳2瓶的方式進行傳代培養，待細胞再次形成單層后，按照上述的細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養，得到一種異育銀鯽腦組織的鯉皰疹病毒II型敏感細胞系GiCB ； 所述的組織分離專用胰蛋白酶消化液為0.59T0.7% W/V胰蛋白酶消化液； 細胞培養、傳代的溫度為25~28°C，pH值7.(T7.4 ； 所述的異育銀鯽腦組織細胞專用培養液為含有1(T20% V/V胎牛血清、l(T20ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子、l(T20ng/ml人表皮細胞生長因子、100U/ml青霉素、lOOl^g/ml鏈霉素、0.25lVml兩性霉素B，pH值7.0~7.4的M199培養液。
3.權利要求1所述細胞系在鯉皰疹病毒II型分離中的應用。
4.權利要求1所述細胞系在鯉皰疹病毒II型培養中的應用。
5.權利要求1所述細胞系在鯉皰疹病毒II型檢測中的應用。
6.權利要求1所述細胞系在制備鯉皰疹病毒II型病疫苗中的應用。
7.權利要求1所述細胞系在作為抗鯉皰疹病毒II型藥物篩選生物模型中的應用。
【文檔編號】C12N7/00GK103667176SQ201310658939
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】馬杰, 曾令兵, 江南, 陳倩, 趙輝 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所