一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法
【專利摘要】一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法屬于一種基因突變的實時熒光定量檢測方法。該方法將real-time?PCR技術與ARMS技術結合，通過特殊的引物設計，大大降低了引物二聚體對檢測過程的干擾，提高了檢測的靈敏度和準確率。同時，采用SYBR?GreenⅠ染料法可以降低檢測的成本。
【專利說明】—種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明設計分子生物學領域，具體涉及一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法。
【背景技術】
[0002]灰霉病是露地、保護地作物常見且比較難防治的一種真菌性病害，屬低溫高濕型病害。灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染所致,屬真菌,半知菌亞門葡萄孢屬。該病菌的寄主多達230余種，除侵染番茄的果實外，還可侵染番茄的莖、葉、花，造成嚴重減產，甚至絕收。該病發生早、蔓延快、危害重、損失大，嚴重影響蔬菜生產。目前，對于農作物的灰霉病，生產上以化學防治為主。傳統的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯氨基甲酸酯類、苯胺基嘧啶類等，但國內外報道灰霉病菌對常用化學殺菌劑已經產生不同程度的抗藥性。啶酰菌胺是德國巴斯夫公司開發的新型煙酰胺類內吸性殺菌劑，是線粒體呼吸鏈中琥珀酸輔酶Q還原酶抑制劑，投入使用時間相對較短，對灰葡萄孢菌的殺滅效果比較好。但是仍然有少數地區產生了啶酰菌胺抗性突變菌株，其突變主要為細胞色素b的272位密碼子突變，影響了鐵硫蛋白第三個Fe-S簇，即H272Y，密碼子由CAC突變為TAC。
[0003]目前在檢測植物真菌抗藥性突變時，采用的主要方法有菌株培養法、直接測序法、傳統擴增耐突變系統即ARMS法、Taqman-ARMS法等。其中，菌株培養法和直接測序法費時費力，周期很長，而傳統ARMS法、Taqman-ARMS法等相對有時間短、效率高等特點，但是又有非閉管式反應、只能定性檢測、成本高等方面的缺點。目前很少有人將SYBR GreenI Real-Time PCR技術應用于點突變檢測。SYBR Green I實時熒光定量PCR相對于其他檢測方法有一個明顯的優勢就是檢測的靈敏度高，樣本中只有幾個拷貝的模板時仍然可以檢測到，比Taqman實時熒光定量PCR還要高一個數量級，同時SYBR Green I法的成本與Taqman法相比也大大降低。但是，正是由于其檢測靈敏度非常高，PCR過程中產生的引物二聚體會對檢測結果產生很大影響，假陽性結果非常嚴重。這使得該方法檢測低拷貝數模板時的靈敏度不高。
[0004]對于田間菌株,在ARMS技術的基礎上，結合SYBR Green real-time PCR技術,能夠實現對SdhB不同基因型的快速鑒定，大大降低檢測的成本，提高檢測的靈敏度。同時，由于本方法為閉管式反應，提取DNA后的步驟均在PCR管中進行，不需將PCR管打開，減少了污染的可能性。本方法可以為田間用藥提供技術指導。
【發明內容】
[0005]本發明是在已知灰葡萄孢菌對啶酰菌胺抗藥性突變的基礎上，發明的一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法。本發明無需將菌株進行特殊處理，直接將樣本提取DNA后即可用于檢測，根據檢測的結果即可得知樣本的基因型，檢測的準確率可達到95%以上。同時由于本發明相對于其它點突變檢測方法能夠大大降低成本，因此對于及時采取科學有效的措施控制灰霉病的發展流行，具有一定的實用價值。
[0006]本發明采用SYBR Green I實時熒光定量PCR技術。SYBR Green I實時熒光定量PCR技術由于引物二聚體的大量擴增，導致非特異性特別強，從而對低拷貝數的模板定量非常不準或者完全無法定量。本發明中設計的引物在擴增中產生的引物二聚體少，使得本方法最低能夠檢測到幾十個拷貝數的模板分子。
[0007]本發明依據傳統ARMS-PCR技術原理，野生型ARMS引物的3’末端堿基只與野生型模板匹配，在擴增突變型模板時的擴增效率會大大降低；突變型ARMS引物的3’末端堿基只與突變型模板匹配，在擴增野生型模板時的擴增效率會大大降低。在引物3’末端倒數第二、三、四位引入的額外錯配堿基能夠進一步降低擴增非特異性模板時的效率，對于特異性模板的擴增效率基本保持不變，從而使得ARMS引物在擴增模板時能夠將兩種模板區分開來。
[0008]本發明突出的優點是:⑴準確率高。通過獨特的引物設計，能夠將準確率提高到95%以上。⑵減少了檢測的工作量，降低檢測所需的成本，適合高通量檢測。⑶檢測所需時間短，僅需6小時。⑷閉管檢測，能夠減少污染的可能性。
[0009]本發明的目的是這樣實現的: [0010]一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法，其體系包括PCR緩沖液、Taq DNA擴增酶、SYBR Green I熒光染料、dNTP、用于檢測模板中所有SdhB基因的通用引物對、用于檢測模板是否為野生型基因的ARMS引物對、用于檢測模板是否為突變型基因的ARMS引物對。采用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司，提取待測樣品的基因組DNA。
[0011]所述三對引物的上游引物序列一致，均為:SEQ ID NO: 15’ CAG AAGGAA GAG AAT ACT TG3’ ；優選的，所述通用引物的下游引物序列為:SEQ IDNO: 25 ’ TCGAGCAGTTGAGAATAGTG3 ’ ；優選的，所述擴增野生型基因ARMS引物的下游序列為:SEQ ID N0:45，GAG CAG TTG AGA ATA GTG CG3’;優選的，所述擴增突變型基因ARMS引物的下游序列為:SEQ ID NO: 125’ GAGCAGTTGAGAATAGAG TA3’。
[0012]進行三組PCR反應，其中第一組用通用引物對來擴增全部SdhB基因，作為檢測的陽性對照，反應的混合液用如下方式配制:
【權利要求】
1.一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法，其特征在于共分兩步: 第一步:提取待測樣品的基因組DNA ； 第二步:運用三對引物，包括一對通用引物、兩對ARMS引物，進行三組實時熒光定量PCR反應； 所述通用引物的序列為: 上游引物:SEQ ID NO: 15，CAG AAG GAA GAG AAT ACT TG3， 下游引物:SEQ ID NO:25，TCG AGC AGT TGA GAA TAG TG3， 所述第一對ARMS弓丨物的上游引物與通用引物的上游引物相同，為SEQ ID NO:1,下游引物為下列引物之一:
SEQ ID NO:35’ GAG CAG TTG AGA ATA GTG CG3’
SEQ ID NO:45’ GAG CAG TTG AGA ATA GTG AG3’
SEQ ID NO:55’ GAG CAG TTG AGA ATA GTC AG3’
SEQ ID NO:65’ GAG CAG TTG AGA ATA GTT AG3’
SEQ ID NO:75’ GAG CAG TTG AGA ATA GCG AG3’
SEQ ID NO:85’ GAG CAG TTG AGA ATA GAC TG3’ 所述第二對ARMS弓丨物的上游引物與通用引物的上游引物相同，為SEQ ID NO:1，下游引物為下列引物之一:
SEQ ID NO:95’ GAG CAG TTG AGA ATA GTG CA3’
SEQ ID NO: 105’ GAG CAG TTG AGAATA GTGGA3’
SEQ ID NO: 115’ GAG CAG TTG AGA ATA GTCTA3’
SEQ ID NO: 125’ GAG CAG TTG AGA ATA GAG TA3’
SEQ ID NO: 135’ GAG CAG TTG AGA ATA GACTA3’ PCR反應體系的配制及擴增程序: ⑴通用引物的擴增: 反應混合液的配制:
2.根據權利要求1所述的一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法，其特征在于:在第二步中所述第一對ARMS引物的下游引物為SEQ ID N0:4。
3.根據權利要求1所述的一種基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突變檢測方法，其特征在于:在第二步中所述第二對ARMS引物的下游引物為SEQ ID NO: 12ο
【文檔編號】C12Q1/04GK103725776SQ201310658832
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月8日 優先權日:2013年12月8日
【發明者】謝飛, 呂寶北, 馬雪梅, 江洪, 劉珊珊 申請人:北京工業大學, 北京泰格瑞分子檢驗有限公司