油菜品系6f313中含油量性狀主效基因位點及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種油菜含油量性狀主效基因位點及應用,步驟包括：1）利用高低含油量組合6F313（50%）和Y817（35%）雜交獲得含油量性狀分離的F2代群體及F2:3家系；2）利用油菜60K的SNP芯片構建F2代分離群體的連鎖圖譜，根據F2群體及F2:3家系的含油量數據獲得含油量性狀緊密連鎖的分子標記并得到主效基因位點。本發明公開了位于A10染色體上控制油菜6F313高含油量性狀主效基因位點6F313A10OC，同時公開了與主效基因位點緊密連鎖的2個分子標記6F313A10OC-1和6F313A10OC-2。通過緊密連鎖的分子標記檢測6F313及其衍生品種（系）中是否含有該主效QTL位點，可預測其含油量高低，大大提高含油量育種的選擇效率。
【專利說明】油菜品系6F313中含油量性狀主效基因位點及應用
【技術領域】[0001]本發明屬于分子生物學及遺傳育種【技術領域】。更具體涉及一種油菜含油量性狀主效基因位點及主效基因位點緊密連鎖的分子標記，同時還涉及分子標記在油菜含油量育種中的應用。
【背景技術】
[0002]作為世界四大油料作物之一，油菜生產對保障我國食用植物油脂和飼用蛋白質的有效供給，對改善食物結構，促進養殖業和加工業發展等諸方面均有重要影響。雖然我國油菜種植面積和產量均居世界第一，但遠不能滿足國內的消費需求，63%左右的食用植物油依賴進口。隨著人口數量的增長和人民生活水平的提高，預計到2010年我國食用植物油消費量將增加到2，500萬噸，按目前的生產規模，缺口將更加巨大。盡管油料市場需求如此，農民種植油菜的積極性卻不高。造成這種局面的主要原因之一是我國的油菜籽比主要出口國加拿大生產的油菜籽含油量5個百分點左右，且成本高，市場競爭力相對較弱。因此，從保障食物油供給安全和增加農民收入的角度考慮，較大幅度增加單位面積菜籽油的產出量是解決目前狀況的對策之一。
[0003]我國油菜研究和育種工作具有較深厚的基礎，一些領域處于世界領先地位。油菜高油分育種的途徑主要有多世代的單株選擇、種間雜交、黃籽油菜育種和誘變選育。
[0004]近年來，隨著基因組學研究取得一系列突破，以分子標記選擇、轉基因和品種分子設計為代表的分子育種技術的成功應用，大大提高了作物遺傳育種水平。與常規育種相比，該技術可以通過分析與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記判斷目的基因的存在與否，并進行精細定位。同時，利用分子標記進行輔助選擇育種，減少了盲目性，縮短育種年限，大大提高了選擇效率。分子標記輔助選擇育種技術的關鍵是與重要農藝性狀緊密連鎖的DNA分子標記的鑒定。美國、日本、西歐各國等國家近年都投入巨資開展這方面的工作。伴隨著水稻，小麥、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些農藝性狀的分子標記的開發，利用鑒定到的分子標記進行輔助選擇育種主要包括種質資源的鑒定、基因定位、基因累加或聚合、異源目的基因的篩選和鑒定以及遺傳圖譜的構建等，育種目標包括抗病、抗蟲、抗旱、高產、品質改良等各個方面。隨著生物技術的發展，油菜分子標記的研究日漸受到關注，研究的領域涉及遺傳圖譜的構建、基因標記和基因定位、親緣關系分析、品種純度鑒定、標記輔助選擇等多方面，并取得了重要進展。但與發達國家相比，我國的油菜分子育種研究工作還有較大差距，主要體現在:不能有效地發掘和利用種質資源中的有利基因，缺乏有自主知識產權及育種價值的基因和標記等。
[0005]目前常用的分子標記技術大致可分為兩種，一種是基于southern雜交技術，另一種則以PCR技術為核心。Grodzicker等(1974)倉丨」立了限制性片段長度多態性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)標記技術。Botstein 等(1980)首先提出用限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,簡稱 RFLP)作為遺傳標記構建遺傳圖譜的設想，從而開創了利用分子標記作為遺傳標記的新時期。隨后幾十種基于Southern雜交或聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的DNA分子標記技術陸續建立，這些DNA分子標記所檢測的多態性在基因組的位置大多為隨機分布，因此可以通稱為隨機DNA分子標記(random DNA markers, RDMs)。RDMs的發展大大提高了人們對基因組多樣性、遺傳作圖等的研究效率，并廣泛的應用于植物科學的研究中。
[0006]大多數重要的農藝性狀均表現數量性狀的遺傳特點，如產量性狀、成熟期、品質、抗旱性等。數量性狀易受環境條件的影響，因此選擇效果不好。傳統育種方法周期長，主要是由數量性狀造成的。由于分子標記技術的發展，人們已可將復雜的數量性狀進行分解，象研究質量性狀基因一樣對控制數量性狀的多個基因進行研究。QTL是在高密度的遺傳圖譜基礎上，通過一定實驗設計，獲得分子標記，借助Mapmarker軟件分析確定控制某一丨I"生狀的基因在染色體上的位置。當目標性狀由少數幾個基因控制時用標記選擇，對發掘遺傳潛力非常有效。
[0007]目前對油菜種子含油量的QTL定位研究也有一些報道，通常檢測出的QTL數目較多，但效應值較小，較難在油菜育種中應用。本研究通過遺傳分析及QTL定位，旨在篩選對種子含油量具有正向效應的QTL，用于油菜含油量的標記輔助選擇。
【發明內容】
[0008] 本發明目的是在于提供了一種油菜含油量性狀的一個主效基因位點6F313A100C。該主效基因位點不但有助于深入了解6F313品系中含油量QTL位點的作用和分布，同時為今后含油量主效基因的克隆提供了一定的基礎。
[0009]本發明的另一個目的是在于提供了一種與油菜含油量性狀主效基因位點緊密連鎖的兩個分子標記6F313A100C-1和6F313A100C-2。與含油量緊密連鎖的分子標記對今后6F313及其衍生品系的含油量性狀育種提供了極大的便利。
[0010]本發明的再一個目的是在于提供了上述含油量緊密連鎖分子標記在油菜高含油量性狀育種中的應用。利用該標記能快速篩選到高油材料，從而在苗期就能進行高油材料篩選，降低了育種成本，節省了人工費用。
[0011]為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施:
[0012]一種油菜含油量性狀主效基因位點的發掘方法，它包括如下步驟:
[0013]a)利用油菜高低含油量組合6F313 (50%)和Y817 (35%)進行雜交，Fl代自交產生F2代分離群體；
[0014]b)提取親本6F313和Y817、F1代及F2代分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括 CTAB 提取液(0.2M Tris — C1，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5% (質量比)SDS，pH7.5)、氯仿、異戊醇、無水乙醇；
[0015]c)利用Illumina公司研制的60K油菜SNP芯片對油菜兩親本及F2分離群體DNA樣品進行分型。在親本中篩選到有多態性的SNP位點后，獲得多態性SNP位點在F2群體中的分布；
[0016]d)通過在F2代分離群體中的分布構建遺傳圖譜，借助含油量數據進行QTL位點分析，并得到與含油量性狀主效基因緊密連鎖的4-8個SNP標記，其中兩個轉化成方便檢測的SNP標記6F313A100C-1和6F313A100C-2。過程中所用到的主要軟件包括Joinmap3.0、WinQTL cart4.0 (商業途徑獲得)。[0017]本研究中所用的親本材料為含油量相差近15個百分點的6F313 (50%)和Y817(35%)，均由中國農科院油料所生物技術育種課題組技術人員在王漢中研究員帶領下育成。6F313品系由以中雙9號高油選株與華黃I號雜交獲得的Fl為母體，以中雙4號高油選株作父本進行復合雜交，獲得基礎群體，通過選優良單株進行小孢子培養和染色體加倍，最終經高油定向選擇得到(所有權歸本課題組所有)。Y817是雜交品種中油雜I號的保持系(中油雜一號制種技術研究與應用，農村經濟與科技，2001年第10期)。油菜兩親本、Fl及F2分離群體單株含油量的測定由近紅外分析儀完成，植物葉片總DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳均為常用的分子生物學技術，通常按照常規條件如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等人(Blackwell科學出版社，1988)所述的條件進行。實驗過程中涉及的所有試劑成分(【具體實施方式】中所列)均可從商業途徑獲得，并按照實驗手冊中的條件或所用試劑制造廠商所建議的條件使用。
[0018]利用上述技術措施， 申請人:最終獲得了含油量性狀相關的一個主效基因位點，具體如下:一種分離的油菜含油量性狀的主效基因位點，主效效基因位點的分子標記為6F313A100C-1 和 6F313A100C-2，其引物序列分別為:6F313A100C_1F:
[0019]5，-CTCAGTTCACAACTCCAGTG-3，；6F313A100C-1R:
[0020]5，-TCTCTCAAGGATCCCTTCGA-3，；6F313A100C-2F: [0021]5， -CCCATCATCAAAATAGATGGTG-3， ；6F313A100C-2R:
[0022]5’ -CCAGTTCTTGGCACAGTCTTGA-3’。6F313A100C，該主效基因位點位于第 AlO染色體，由6F313A100C-1和6F313A100C-2 (自主開發SNP標記)定位，其引物序列為6F313A100C-1和6F313A100C-2。利用Joinmap3.0軟件分析測得與含油量性狀(2010年和2012年兩年數據)不相關的概率P值為0.0001，兩年的貢獻率分別為24.05%和15.8% ；
[0023]所述的QTL是quantitative trait locus的縮寫，中文可以翻譯成數量性狀座位或者數量性狀基因座，它指的是控制數量性狀的基因在基因組中的位置。對QTL的定位必須使用遺傳標記，人們通過尋找遺傳標記和感興趣的數量性狀之間的聯系，將一個或多個QTL定位到位于同一染色體的遺傳標記旁，換句話說，標記和QTL是連鎖的。近幾年QTL定位應用的較為廣泛，在人類基因上與疾病有關的基因定位甚多；植物上，模式植物抗逆性基因的定位較多。
[0024]一種油菜含油量性狀的主效基因位點在油菜高含油量性狀育種中的應用，其步驟是:
[0025]A、利用6F313高油品系與另一高產但含油量僅為44%左右的品種中雙9號雜交后種植F2代，在F2代苗期利用主效位點的分子標記引物6F313A100C-1和6F313A100C-2進行分子鑒定。
[0026]B、種子收獲后的含油量測試結果表明，通過分子標記輔助選擇得到的植株含油量超過48%的占83%。
[0027]C、通過鑒定上述主效基因位點來預測油菜種子含油量，可迅速提高油菜高含油量品種的育種進程。
[0028]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0029]本發明首次定位了油菜品系6F313中的一個含油量性狀主效基因位點，可解釋含油量24.05%的變化，使得油菜含油量性狀主效基因位點的定位工作居于同領域前列。傳統育種方法中，表型鑒定要等到收獲種子測定含油量，且受環境影響較大。因此含油量育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測含油量性狀主效QTL位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。本發明中含油量主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方便快速，不受環境影響。通過檢測與含油量性狀相關的分子標記，即可以預測含油量的高低，進而可以快速篩選高含油量株系用于油菜含油量育種，輔助育種選擇目標明確，節約成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為一種武漢陽邏F2群體、F2:3家系含油量分布圖。
[0031]結果表明含油量表現分布呈連續性分布，變異分布呈正態分布，且變異范圍很寬，證明含油量屬于數量性狀。
[0032]圖2為一種位于AlO染色體上的QTL位點。
[0033]圖3為一種根據2010F2含油量數據分析6F313A100C含油量性狀主效基因位點。
[0034]圖4為一種分子標記6F313A100C-1和6F313A100C-2在F2代株系中的篩選。
[0035]圖中1、2、5、8號為高含油量株系。
【具體實施方式】
[0036]通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New YorkiColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等人(Blackwell 科學出版社,1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。
[0037]實施例1:
[0038]高低含油量油菜品系組合F2分離群體的構建及F2、F2:3家系含油量的測定
[0039]本實施例中使用的群體為高低含油量親本(含油量分別為50%的6F313和35%的Y817)雜交后代一F2代。親本、Fl及F2種子含油量由近紅外分析儀測定。F2代分離群體含油量數據分布結果表明含油量表現分布呈連續性分布，變異分布呈正態分布，且變異范圍很寬，證明含油量屬于數量性狀(圖1)。
[0040]實施例2:
[0041]親本、Fl及F2分離群體葉片總DNA的提取
[0042]利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下:
[0043]A.適量葉片樣品取自超低溫冰箱(_70°C)，立即放入冰凍過的研缽中，加入液氮研磨成粉狀；快速裝入50ml離心管中，加入在60°C的水浴鍋中預熱過的提取液(0.2MTris — C1，0.25NaCl,25mM EDTA，0.5% (質量比)SDS, pH7.5)，混合均勻，放入 60°C 的水浴鍋中水浴40min ；
[0044]B.取出離心管，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1，V/V)，緩慢上下顛倒離心管30-50次，使充分混勻，1300g離心10分鐘；
[0045]C.取上清于另一離心管中，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1，V/V)，重新抽提一次。取上清加入0.6倍體積冰冷異戊醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結為止。靜止30min,挑出沉淀，70%(體積比)酒精洗2_3次，無水乙醇洗一次，干燥后加無菌水65°C 20min溶解；
[0046]D.再次加入等體積氯仿:異戊醇(24:1，V/V)，重新抽提。取上清，加入0.1倍NaAc(3mol/L, PH5.2)，混勻后緩慢加入2倍體積的冰無水乙醇，靜止5min后緩慢轉動離心管直至絮狀沉淀出現，挑出沉淀轉入1.5ml離心管中，70% (體積比)酒精洗2-3次，無水乙醇洗一次，干燥后加無菌水溶解，于_20°C冰箱中保存備用。
[0047]實施例3:
[0048]SNP芯片分析6F313、Y817兩親本及F2分離群體的基因型及連鎖分析
[0049]利用Illumina公司研制的60K油菜SNP芯片對油菜兩親本及F2分離群體DNA樣品進行分型。在親本中篩選到有多態性的SNP位點后，分析其在F2群體中的分布。通過在F2代分離群體中的分布進行數據分析，根據連鎖交換規律，利用群體基因型資料構建油菜的遺傳圖譜，所用軟件為Joinmap3.0，最小LOD值設為2.5，獲得連鎖圖譜(圖2為AlO染色體連鎖群圖譜)。將F2群體的105個單株的含油量數據及多態性引物的分布情況輸入計算機，運行WinQTL cart4.0軟件對數據進行關聯性分析，單向方差分析測得與含油量性狀相關的概率P值和位點對含油量性狀的貢獻率(表2，圖3)。結果表明，P〈0.0001的SNP分子標記即與主效基因位點連鎖。利用SNP位點差異及基因組序列開發出兩對SNP標記引物，可直接PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳分型用于標記輔助選擇育種(表1)。PCR反應體系為:20ul體系，DNA模板Iul (濃度為50ng/ul)，上下游引物各Iul (濃度均為IOumol )，dNTP0.5ul，Taq酶 0.5ul (5u/ul)，MgC122ul，ddH2014ul。反應的時間和溫度作如下-MV 3min，94°C 45s，62°C 45s, 72°C 30s, 30cycles, 72°C 5min。PCR產物用2% (質量比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0050]表1標記弓丨物的序列
[0051]
【權利要求】
1.一種分離的油菜含油量性狀的主效基因位點，其特征在于:主效效基因位點的分子標記為6F313A100C-1和6F313A100C-2,其引物序列分別為:6F313A100C-1F:5’ -CTCAGTTCACAACTCCAGTG-3’ ； 6F313A100C-1R:5’ -TCTCTCAAGGATCCCTTCGA-3’ ；6F313A100C-2F:5’ -CCCATCATCAAAATAGATGGTG-3 J ； 6F3I3A100C-2R:5’ -CCAGTTCTTGGCACAGTCTTGA-3’。
2.權利要求1所述的一種分離的油菜含油量性狀的主效基因位點在油菜高含油量性狀育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103667484SQ201310658487
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】王漢中, 華瑋, 劉靜, 劉貴華, 王新發, 胡志勇, 楊紅麗 申請人:中國農業科學院油料作物研究所