一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，通過副溶血性弧菌陽性標(biāo)本制備、副溶血性弧菌濃縮富集、副溶血性弧菌核酸提取、引物設(shè)計、模板制備、基因擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物分析等步驟完成。本發(fā)明實現(xiàn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌鑒定方法，這種方法省時，省力，檢測靈敏度高，能夠很好滿足人們對水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類等日益嚴(yán)格的質(zhì)量要求，并且這種方法對于其他致病微生物的檢測具有指導(dǎo)意義。
【專利說明】—種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，特別是涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水產(chǎn)養(yǎng)殖動物具有低脂肪、高蛋白的特點(diǎn)，肉質(zhì)鮮美，膳食結(jié)構(gòu)合理，深受廣大消費(fèi)者的青睞。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，復(fù)雜的水體環(huán)境使水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)常會滋生一些致病性微生物，如果這些致病微生物殘留，富集在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)就會嚴(yán)重危害食用者的健康。
[0003]副溶血性弧菌是眾多致病性微生物中較為常見的一種，它是一種嗜鹽性細(xì)菌，主要來自海產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，存活能力強(qiáng)，海水中可存活47天。食物中毒一般表現(xiàn)為急發(fā)病，臨床上以腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。
[0004]目前，使用傳統(tǒng)的檢測方法，即非選擇性和選擇性增菌、生長法及血清學(xué)鑒定雖然比較準(zhǔn)確，但費(fèi)力、耗時，一般需4一7 d才能完成，這對水產(chǎn)養(yǎng)殖及后期的加工處理是不現(xiàn)實的。因此，急需一些快速、特異、敏感的檢測方法來及時發(fā)現(xiàn)致病菌，控制污染及其可能對人體健康產(chǎn)生的危害。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明主要解 決的技術(shù)問題是提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，能夠解決現(xiàn)有致病微生物檢測方法存在的費(fèi)時，費(fèi)力，特異性不強(qiáng)的問題。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，檢測步驟包括:
Cl)副溶血性弧菌陽性標(biāo)本制備:取300~800ml，濃度為5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10條15~20cm的鲅魚海水魚缸中，成為人為模擬的陽性標(biāo)本；
(2)副溶血性弧菌濃縮富集:分別取陽性標(biāo)本和待測樣本各4~5條，陽性標(biāo)本和待測樣本分別取20~100g的魚鱗，將所取魚鱗分別加入pH為7.5的甘氨酸緩沖液中，攪拌均勻后室溫放置，再在2~4°C下以5 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取上清并調(diào)節(jié)pH為7.0，在2~4°C靜置2 h，以8 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，將離心后的沉淀用15mL pH為6.75的磷酸鹽緩沖液重懸；
(3)副溶血性弧菌核酸提取:將步驟(2)中5~IOml溶液用凱杰DNA提取試劑盒提取
DNA ；
(4 )引物設(shè)計:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ；
(5)模板制備:將步驟(3)中獲得的提取液在_4°C下以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取沉淀，一定溫度下放置15~30分鐘；
(6)基因擴(kuò)增:將步驟(5)中制備的模板放置于PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行基因擴(kuò)增；
(7)PCR產(chǎn)物分析:將步驟(6)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀觀察DNA帶，與陽性標(biāo)本DNA帶比較即可判斷待測樣本中是否具有檢測限以上的副溶血性弧菌。
[0007]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述步驟(1)中副溶血性弧菌原液體積為600ml。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述步驟(2)中標(biāo)本和待測樣本的魚鱗分別為80mgo
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述步驟(3)中的溶液為10ml。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述步驟(5)中放置溫度為25°C。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述步驟(6)中PCR擴(kuò)增體系為10 X PCR緩沖液2uL, Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超純水5.4ul，模板lul。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，實現(xiàn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌鑒定方法，這種方法省時，省力，檢測靈敏度高，能夠很好滿足人們對水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類等日益嚴(yán)格的質(zhì)量要求。并且這種方法對于其他致病微生物的檢測具有指導(dǎo)意義。
【具體實施方式】
[0013]下面對本發(fā)明的較佳實施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0014]本發(fā)明實施例包括:
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法,檢測步驟包括:
Cl)副溶血性弧菌陽性標(biāo)本制備:取300~800ml，濃度為5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10條15~20cm的鲅魚海水魚缸中，成為人為模擬的陽性標(biāo)本；
(2)副溶血性弧菌濃縮富集:分別取陽性標(biāo)本和待測樣本各4~5條，陽性標(biāo)本和待測樣本分別取20~100g的魚鱗，將所取魚鱗分別加入pH為7.5的甘氨酸緩沖液中，攪拌均勻后室溫放置，再在2~4°C下以5 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取上清并調(diào)節(jié)pH為7.0，在2~4°C靜置2 h，以8 000轉(zhuǎn)/ 分的轉(zhuǎn)速離心，將離心后的沉淀用15mL pH為6.75的磷酸鹽緩沖液重懸；
(3)副溶血性弧菌核酸提取:將步驟(2)中5~IOml溶液用凱杰DNA提取試劑盒提取
DNA ；
(4 )引物設(shè)計:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ；
(5)模板制備:將步驟(3)中獲得的提取液在_4°C下以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取沉淀，一定溫度下放置15~30分鐘；
(6)基因擴(kuò)增:將步驟(5)中制備的模板放置于PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行基因擴(kuò)增；所述擴(kuò)增體系為10 X PCR緩沖液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超純水5.4ul，模板lul。
[0015](7)PCR產(chǎn)物分析:將步驟(6)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀觀察DNA帶，與陽性標(biāo)本DNA帶比較即可判斷待測樣本中是否具有檢測限以上的副溶血性弧菌。
[0016]實施例1
取600ml,濃度為5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入Im3,含10條15~20cm的鲅魚海水魚缸中，成為人為模擬的陽性標(biāo)本；分別取陽性標(biāo)本和待測樣本各5條，陽性標(biāo)本和待測樣本分別取80g的魚鱗，將所取魚鱗分別加入pH為7.5的甘氨酸緩沖液中，攪拌均勻后室溫放置，再在2~4°C下以5 OOO轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取上清并調(diào)節(jié)pH為7.0，在2~4°C靜置2 h，以8 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，將離心后的沉淀用15mL pH為6.75的磷酸鹽緩沖液重懸；取重懸后的溶液IOml用凱杰DNA提取試劑盒提取DNA ;上游引物AGACAACTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGAAATAG ；將 DNA 提取液在 _4°C 下以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取沉淀，在25°C下放置15分鐘，然后進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10 X PCR緩沖液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超純水5.4ul，模板 lul。
[0017] 將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀觀察DNA帶，與陽性標(biāo)本DNA帶比較即可判斷待測樣本中是否具有檢測限以上的副溶血性弧菌。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，檢測步驟包括: (1)副溶血性弧菌陽性標(biāo)本制備:取300~800ml，濃度為5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入lm3，含10條15~20cm的鲅魚海水魚缸中，成為人為模擬的陽性標(biāo)本； (2)副溶血性弧菌濃縮富集:分別取陽性標(biāo)本和待測樣本各4~5條，陽性標(biāo)本和待測樣本分別取20~100g的魚鱗，將所取魚鱗分別加入pH為7.5的甘氨酸緩沖液中，攪拌均勻后室溫放置，再在2~4°C下以5 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取上清并調(diào)節(jié)pH為7.0，在2~4°C靜置2 h，以8 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，將離心后的沉淀用15mL pH為6.75的磷酸鹽緩沖液重懸； (3)副溶血性弧菌核酸提取:將步驟(2)中5~IOml溶液用凱杰DNA提取試劑盒提取 DNA ； (4 )引物設(shè)計:上游弓丨物 AGACMCTATGATGCAGATTA 下游引物 TGATCATCACGATAGMATAG ； (5)模板制備:將步驟(3)中獲得的提取液在_4°C下以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心，取沉淀，一定溫度下放置15~30分鐘； (6)基因擴(kuò)增:將步驟(5)中制備的模板放置于PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行基因擴(kuò)增； (7)PCR產(chǎn)物分析:將步驟(6)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像儀觀察DNA帶，與陽性標(biāo)本DNA帶比較即可判斷待測樣本中是否具有檢測限以上的副溶血性弧菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中副溶血性弧菌原液體積為600ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中標(biāo)本和待測樣本的魚鱗分別為80mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的溶液為10ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(5)中放置溫度為25°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留副溶血性弧菌PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(6)中PCR擴(kuò)增體系為10 X PCR緩沖液2uL，Taq酶lul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg2+6.6ul，超純水5.4ul，模板lul。
【文檔編號】C12Q1/04GK103740813SQ201310657472
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】杜偉林 申請人:蘇州市相城區(qū)新時代特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場