一種小麥籽粒硬度基因的ssr分子標記方法
【專利摘要】本發明公開了一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法，它涉及小麥分子標記輔助育種【技術領域】，它通過在與硬度基因緊密連鎖的一個具有微衛星特征的核苷酸序列中設計包含該微衛星重復區段的PCR引物，對目標品種進行PCR擴增后，通過聚丙烯酰胺電泳，可以對品種間Pina和Pinb基因的等位變異進行判定，具有簡便、快速、穩定性高和等位基因多樣性高等優點，僅采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳即可完成。
【專利說明】—種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于小麥分子標記輔助育種【技術領域】，涉及一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法。
【背景技術】:
[0002]籽粒硬度是國內外小麥市場分級和定價的重要依據。它能夠影響面粉顆粒度大小、出粉率、潤麥加水量、破損淀粉粒數量。硬度值小的小麥磨制的面粉顆粒度較小、破損淀粉含量低，吸水能力較弱，而硬度值大的小麥磨制的面粉顆粒度大、破損淀粉含量高，具有較強的吸水能力。這些特性的差異影響揉制面團特性，從而影響制作食品的類型。如軟質小麥適合于制作餅干和糕點等甜食類食品；硬質麥面粉適合制作面包和優質面條等食品。
[0003]小麥的籽粒硬度性狀主要由位于小麥染色體短臂上緊密連鎖的Puroindoinea (Pina)和Puroindoine b (Pinb)基因調節,兩個基因編碼區在染色體上的間距為17kb。Pina和Pinb基因都處于野生狀態時，籽粒表現為軟質；當Pina或Pinb基因任一基因缺失或突變時，籽粒表現為硬質；當缺乏D組染色體時，籽粒硬度最大，稱硬粒麥，又稱杜倫麥(Durum)。目前，已在普通小麥中發現大量Pina和Pinb基因的突變類型，除少部分為片段缺失以外，多為單堿基突變。如常見的硬質小麥類型Pinb-Dlb，是Pinb基因中223位點的鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)，導致該基因的氨基酸序列中第46位點的甘氨酸(Glycine，Gly)突變為絲氨酸(Serine, Ser)。
[0004]而目前SNP主要檢測方法有如下缺陷:一、以凝膠電泳為基礎的傳統檢測方法,如限制性片段長度多態性、變性梯度凝膠電泳、等位基因特異PCR等，檢測靈敏度低；二、核苷酸測序法，需要昂貴的3730測序儀，每個樣品的成本在10元左右；三、基因芯片，同樣需要昂貴的儀器，四、Taqman探針法，合成一條熒光引物的成本在300元左右。`
【發明內容】
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[0005]針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法。
[0006]在NCBI數據庫中檢索到包含pina和pinb基因的BAC序列，該BAC庫包含187kb的核苷酸序列，通過SSRfinder軟件尋找到20個具有簡單重復的序列，根據SSR位點的重復序列的特征和Pina和pinb基因的距離核苷酸長度設計了 4對PCR引物。SSR5的正向引物為 GTTCGGGAGGTACCATAITT，反向引物為 AGTGGGGGTTAAGGAGTG ；SSR7 的正向引物為 CAAGTTTAGTTTCGCAAAA，反向引物為 TGTATGTGCAACTTTGTGAAG ；SSR9 的正向引物為 TTCAGCTTAACCATTCCTACA，反向引物為 CCTTCGAACCTAATGAAATCT ；SSR15 的正向引物為TCGTACAGAGGGAAGTTCAG，反向引物為 GCAGATGGAGTCTACACACTT。SSR5 和 SSR7 引物具有有效擴增，而SSR7具有明顯的多態性。在187個普通小麥品種中發現4種等位變異，測序后發現核苷酸長度分別為 149bps, 151bps, 153bps, 155bps。SSR7-1 中 AG 重復 17 次，SSR7-2 中 AG重復18次，SSR7-3中AG重復19次，SSR7-4中AG重復20次，利用聚丙烯酰胺電泳可以清晰地將目標類型分開。對4中類型的不同品種的pina和pinb基因進行測序后發現，SSR7-3類型檢測到野生型，SSR7-4類型中檢測到Pinb-DlC突變，而SSR7-2類型檢測到Pinb-DIB，而 SSR7-1 檢測至Ij Pinb-Dlx0
[0007]本發明的有益效果為:SSR7所包含的由A和G兩個堿基組成的基本序列串聯重復組成的短片段，設計的SSR分子標記為共顯性標記，僅采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳即可完成，具有簡便、快速、穩定性高和等位基因多樣性高等優點。
【具體實施方式】:
[0008]本【具體實施方式】采用以下技術方案:它通過在與硬度基因緊密連鎖的一個具有SSR特征的核苷酸序列中設計包含該SSR的PCR引物，對目標品種進行PCR擴增后，通過聚丙烯酰胺電泳，可以對品種間Pina和Pinb基因的等位變異進行判定。
[0009]所述的核苷酸序列為:
[0010]TTATTACTCACCTCGATTTTTGTTTGTAAGTGTGTTTATTTATTGGTCAAAGATAATTGTTTCTGGGGAAAAATGAAGGATTAGAAGAAGCTTGTCATGTGCCGAATCTCAATCTTCGATAAACCAAGGGAGAATAATTAGAAAAGATGGCTATCTAATATGACTCATTGCACTTTCTAGGTCAGAATCAAAACCCTTTTATGGCATTGTACATGGGGAGGTGAGCTCTGTTCTAAGGTTAATCCTAACCCGTGTTGTTTGAAATACCTATTTACCCCCTCCGATGCATCTAGATCCTCGGACACCTTGTTAAAAAAAATTACTTCCTTGGAGACAAATACTATTTTGGAGAATAATGAAAATCATTTAGAAACATTTGACATGAACGACATGATTCCAGAGACAATAAAAAACTTAAAAACAAACGATGGATAAGAAGATGATGTCTTGATAAATCATTACTTGTCGAGTTGTCGTGTACTACTAGTCTGTAAAATACAGTCTCTAACAAATTTGGTACAATCTGAGATCCATCTTGAACAACCTGCACAATCCTACAAGTTTAGTTTCGCAAAAGAATAACAATATGAACCATGTGACTTTCTTGGTACGTACAAAACCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGGTCACACATCATTAGATAAGGTCTATCTTCACAAAGTTGCACATACATGTACAGTACAGGAAGCGACATGTATCTCAATACCACATGGTTCTAGATACTGGACGAAAAAGCAGTGGCTAGAAAGATGACGATATATAGATGCATTACTTATCATATACTACTACCTAGAAAAATACAATATCTAATTTCCTCTTGATCCTTCTTGAACAACCTGCACAACACTACAAGTTCAGTTTCACAAAAGCGTAAGTCTAAAGCTTTGGTACAACAACAACTTATGGTTTATTTTGAGAAAAGGTCAGATTCAGTACACGGAACATCACATATCTCAACAACTTCCACCAGTTTTGTGTGCTTTCAAAGTAACTTTGATTGGTATCCAGCTATACAACACACAACCGCACACAGAAATCGTGCCACCTCAATTATAAATAAAGGTGTGGCCTCATCTCATCTATTCATCTCCACCTGCACCAAAACACACTGACAACATGAAGGCCCTGATCTTCAGAGCAG，其所包含的 SSR 區段為 624-659。
[0011]本【具體實施方式】的具體標記的方法為:
[0012]I，按照CTAB法提取小麥品種新鮮葉片中的DNA，在熱電公司的Nanodrop2000c儀器測定DNA濃度為1245ng/l.! L，稀釋到100ng/ul。
[0013]2，從NCBI數據庫中檢索到包含pina和pinb基因的BAC序列，該BAC庫包含187kb的核苷酸序列，通過SSRfinder軟件尋找到20個具有簡單重復的序列，根據SSR位點的重復序列的特征和Pina和pinb基因的距離核苷酸長度設計了 4對PCR引物。SSR5的正向引物為 GTTCGGGAGGTACCATAITT，反向引物為 AGTGGGGGTTAAGGAGTG ；S SR7 的正向引物為 CAAGTTTAGTTTCGCAAAA，反向引物為 TGTATGTGCAACTTTGTGAAG ；SSR9 的正向引物為 TTCAGCTTAACCATTCCTACA，反向引物為 CCTTCGAACCTAATGAAATCT ；SSR15 的正向引物為TCGTACAGAGGGAAGTTCAG，反向引物為 GCAGATGGAGTCTACACACTT。
[0014]3，PCR 反應體系為: 模板 DNA50ng，dNTP0.25mmol/L, 10*buffer，2.5 μ L，引物濃度0.4 μ mol/L, Taq DNA聚合酶0.5U，總體積為25 μ L。反應程序為:94°C預變性5min ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共40個循環；72°C延伸IOmin0
[0015]4，PCR產物電泳:擴增產物變性:在擴增產物中加入6μ I Loading buffer,95°C變性6min后立刻置于冰水混合物中待用。聚丙烯酰胺變性膠:60ml膠中加入210 μ I APS和70 μ I TEMED0預電泳:恒定功率(參數為80W)，約30min。加入變性的擴增樣品DNA4~6 μ 1，電泳約Ih (視SSR分子量大小及差異帶型的可辨程度調整電泳時間)。擴增產物的銀染顯色:放入染色液(lgAgN03+lL H20)中，輕輕搖動約5min以上。用蒸餾水沖洗約5sec立刻放入顯影液(20g氫氧化鈉溶入IL ddH20后,加入4ml甲醒和200 μ 110mg/ml硫代硫酸鈉)中，至DNA條帶顯出。
[0016]5，記載SSR引物擴展條帶的類型。首先利用10個小麥品種進行引物篩選，SSR9和SSR15引物未能有有效擴展，而有效擴增的SSR5和SSR7引物中SSR7具有明顯的多態性。用SSR7引物對所有品種進行帶型分析，SS7共分為4種類型:SS7-1，SS7-2，SS7-3，SS7-4。
[0017]6，將目標條帶進行回收后送華大基因測序后發現SS7-1，SS7-2，SS7-3，SS7-4分另為 149bps, 151bps, 153bps, 155bps。SSR7-1 中 AG 重復 17 次，SSR7-2 中 AG 重復 18 次，SSR7-3中AG重復19次，SSR7-4中AG重復20次，
[0018]7，結合前人對這187份材料硬度基因測序結果發現:SSR7_1對應等位變異Pinb-Dlx, SSR7-2類型對應Pinb-DIB, SSR7-3類型對應野生型，SSR7-4類型中對應Pinb-DlC 突變。
[0019]本【具體實施方式】發現小麥基因組中一個與pina和pinb基因緊密連鎖的多態性SSR位點，可以用于分子標記輔助選擇育種。
[0020]以上顯示和描述了`本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【權利要求】
1.一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法，其特征在于:它通過在與硬度基因緊密連鎖的一個具有SSR特征的核苷酸序列中設計包含該SSR的PCR引物，對目標品種進行PCR擴增后，通過聚丙烯酰胺電泳，可以對品種間Pina和Pinb基因的等位變異進行判定。
2.根據權利I中所述的一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法，其特征在于:所述的核苷酸序列為:
TTATTACTCACCTCGATTTTTGTTTGTAAGTGTGTTTATTTATTGGTCAAAGATAATTGTTTCTGGGGAAAAATGAAGGATTAGAAGAAGCTTGTCATGTGCCGAATCTCAATCTTCGATAAACCAAGGGAGAATAATTAGAAAAGATGGCTATCTAATATGACTCATTGCACTTTCTAGGTCAGAATCAAAACCCTTTTATGGCATTGTACATGGGGAGGTGAGCTCTGTTCTAAGGTTAATCCTAACCCGTGTTGTTTGAAATACCTATTTACCCCCTCCGATGCATCTAGATCCTCGGACACCTTGTTAAAAAAAATTACTTCCTTGGAGACAAATACTATTTTGGAGAATAATGAAAATCATTTAGAAACATTTGACATGAACGACATGATTCCAGAGACAATAAAAAACTTAAAAACAAACGATGGATAAGAAGATGATGTCTTGATAAATCATTACTTGTCGAGTTGTCGTGTACTACTAGTCTGTAAAATACAGTCTCTAACAAATTTGGTACAATCTGAGATCCATCTTGAACAACCTGCACAATCCTACAAGTTTAGTTTCGCAAAAGAATAACAATATGAACCATGTGACTTTCTTGGTACGTACAAAACCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGGTCACACATCATTAGATAAGGTCTATCTTCACAAAGTTGCACATACATGTACAGTACAGGAAGCGACATGTATCTCAATACCACATGGTTCTAGATACTGGACGAAAAAGCAGTGGCTAGAAAGATGACGATATATAGATGCATTACTTATCATATACTACTACCTAGAAAAATACAATATCTAATTTCCTCTTGATCCTTCTTGAACAACCTGCACAACACTACAAGTTCAGTTTCACAAAAGCGTAAGTCTAAAGCTTTGGTACAACAACAACTTATGGTTTATT TTGAGAAAAGGTCAGATTCAGTACACGGAACATCACATATCTCAACAACTTCCACCAGTTTTGTGTGCTTTCAAAGTAACTTTGATTGGTATCCAGCTATACAACACACAACCGCACACAGAAATCGTGCCACCTCAATTATAAATAAAGGTGTGGCCTCATCTCATCTATTCATCTCCACCTGCACCAAAACACACTGACAACATGAAGGCCCTGATCTTCAGAGCAG，其所包含的 SSR 區段為 624-659。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757096SQ201310655956
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】張懷剛, 劉寶龍, 李善福, 劉登才, 張波, 陳文杰, 沈裕虎, 李建民, 魏樂 申請人:中國科學院西北高原生物研究所