一種海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株及產出的纖溶活性化合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株海洋分離到的產纖溶活性化合物FGFC1的海洋微生物長孢葡萄穗霉菌FG216。該囷株保減于中國典型培養物保減中心(CCTCC),保藏號為CCTCC:M2012227。本發明還公開了利用該海洋微生物長孢葡萄穗霉菌FG216產出的纖溶活性化合物。該纖溶活性化合物FGFC1可極大地促進纖溶酶的溶纖活性，具有極好的成藥性，在醫藥工業上有進一步研究和應用的前景。
【專利說明】一種海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株及產出的纖溶活性化合 物
【技術領域】
[0001] 本發明涉及海洋微生物【技術領域】，特別是涉及一種海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株 及由該海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株產出的纖溶活性化合物。
【背景技術】
[0002] 血栓性疾病如急性心肌梗塞、腦血栓、肺血栓等是嚴重威脅人類健康，甚至危及生 命的主要疾患之一。在發達國家，占人口死亡率的首位疾病是由于血栓所引的疾病及其并 發癥。目前，溶栓療法是心肌梗塞和其它血栓性疾病的常規治療方法，因此，溶栓藥物的研 究在國際上受到高度重視。現在使用的溶栓藥物如鏈激酶（Streptokinase，SK)，尿激酶 (Uropkinase，UK)和組織型纖溶酶原激活劑（Tissue-type plasminogen activator，t_PA) 等都存在半衰期短、易產生再栓塞，并且價格昂貴等問題，而且它們對纖維蛋白無特異性， 產生血栓溶解的同時常伴有出血危險性。
[0003] 針對溶栓藥物應用中出現的上述問題，除了通過蛋白質工程、基因工程等對原有 溶栓藥物進行各種結構和功能上的改造，以開發新型的溶栓藥物以外，探索具有新型溶血 栓作用機理的促溶血栓化合物是心血管疾病研究的重要方向。
[0004] 海洋是一個巨大的生物資源庫，近年來從海洋動植物中分離提取了大量的具有新 型生物活性物質。海洋中微生物數量巨大，因其所處的獨特環境，產生的代謝產物與陸物 微生物有較大差別，因此，海洋細菌、放線菌、真菌、微藻等成為篩選新型活性物質的重要來 源。從海洋微生物代謝產物中發現和研究低分子纖溶促進化合物已成為探索新型纖溶療法 藥物的重要途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于尋找生存在自然環境中特別是海洋中產纖溶活性化合物的微 生物，經發明人廣泛的采樣和大量的篩選，從930株分離得到的微生物中，得到一株產纖 溶活性化合物（FGFCl)活性很高的菌株，該菌株已于2012年7月12日送至中國典型培養物 保藏中心進行保藏，分類命名：海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株（Stachybotrys Iongispora) FG216 (簡稱菌株FG216)，保藏號：CCTCC :M2012227,地址：中國武漢武漢大學。
[0006] 本發明提供的海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株（Stachybotrys longispora)FG216， 是從舟山群島海域離岸100米附近收集的31個樣品中分離得。對菌株FG216基因組DNA提 取，使用通用引物PCR擴增真菌的ITS全長序列，經華大基因公司測序，并將序列提交NCBI 的GenBank進行比。菌株FG216序列與葡萄穗霉菌屬的微生物同源性高，與Stachybotrys longisporal8S rDNA序列的同源性為100%,并據此構建了系統發育樹。
[0007] 本發明的海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株FG216的形態特征為：菌絲體呈白色絨毛 狀，其菌絲400倍光學顯微鏡觀察粗狀、有隔、分枝(參見圖1)。其孢子在400倍光學顯微 鏡觀察呈橢圓形的外部形態特征(參見圖2)。培養特征：在馬鈴薯蔗糖培養基上生長良好。 培養溫度25°C。搖瓶培養用改良察氏培養基：蔗糖50g，硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀0. lg，硫酸 鎂〇. 5g，氯化鉀0. 5g，酵母提取物lg，氯化鈷0. 0025g，硫酸亞鐵0. 015g，氯化鈣0. 0065g， 蒸餾水IOOOmL, ρΗ5· 8。培養溫度25°C。
[0008] 菌株FC216的ITS序列測定：采用改進的CTAB法對菌株FG216基因組提取，使用 通用引物 ITSl (5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '，19bp)和 ITS4 (5' -TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'，20bp)擴增真菌全長序列的ITS，PCR反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電流分離后， 用 Axyprep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, USA)純化 PCR 產物，將純化 后的產物連接pGEM-T載體（Promega公司），連接產物轉化入Eschericha coli DH5a，用 藍白斑篩選并用M13F和M13R引物PCR擴增檢測陽性克隆，選取陽性克隆送華大基因公 司測序。將測得的序列（參見圖4)提交NCBI的GenBank進行比對。下載相似序列，并以 Neighbor-Joining方法構建系統發育樹(見圖3)。
[0009] 本發明由該海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株產出的溶活性化合物，是通過以下步驟 制備的：
[0010] 1).菌種分離：含1%瓊脂的馬鈴薯蔗糖培養基，用海水配制，pH自然，121°C滅菌 20分鐘，例平板，冷卻后以200 μ 1的樣品量涂布每個平板，25°C培養5天后分離得到單菌。
[0011] 2.分離得到的單菌落保藏于馬鈴薯蔗糖斜面培養基；
[0012] 3.發酵培養基的制備：蔗糖50g，硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀0. lg，硫酸鎂0. 5g，氯 化鉀0. 5g，酵母提取物lg，氯化鈷0. 0025g，硫酸亞鐵0. 015g，氯化鈣0. 0065g，蒸餾水 IOOOmLj pH5. 8 ；
[0013] 4.菌株培養：培養溫度25°C，180rpm，培養3天后加入培養液體積1%的賴氨酸，繼 續培養2天；
[0014] 5.活性物質提取：加入等體積的純甲醇，超聲提取15分鐘，IOOOOrpm離心15分 鐘，上清液在40 - 60°C條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥；
[0015] 6. 96孔平板孔內注入纖溶酶原溶液、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑溶液、牛血清 白蛋白和發色底物溶液各1〇μ 1，其濃度分別為〇. l、〇. lmg/mL、500nmol/mL和Immol/mL，加 入樣品溶液10 μ 1后成50 μ 1反應體系；在37°C于405nm處連續150分鐘測定吸光度的變 化；
[0016] 7.促纖溶活性化合物的純化：FG216發酵培養結束后，三角瓶中加入等體積的 100%的甲醇，超聲提取15min，在轉速IOOOOrpm的條件下離心15min，過濾，棄去沉淀，上 清液在40-60°C的條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥12h，殘留物溶于少量甲醇，過濾 棄去沉淀，收集上清液，再減壓濃縮，真空干燥；所得殘留物溶于少量甲醇，用于HPLC分離 采用島津SCL-lOAvp HPLC分離系統，樣品在流速10mL/min，檢測波長265nm的條件下被 色譜柱S印ax HP-C18柱（21.2X250mm，10m)兩次精制，第一次流動相為甲醇：0.05mol/ L乙酸銨=80 : 20,第二次流動相為乙腈：0.1%甲酸=40 : 60,用S印ax HP-C18色譜柱 (4. 6mmX 150mm，5m)鑒定所得化合物的純度。
[0017] 本發明的菌株FG216的發酵液具有促纖溶活性，纖溶活性隨著其代謝化合物的含 量的增加而增加。
[0018] 本發明采用發色底物法評定微生物華誕產物的纖溶促進作用。在纖溶酶原 (Plasminogen, Pig)、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（single chain urokinase-type plasminogen activator, Pro-uPA)、牛血清白蛋白（Bull Serum Albumin, BSA)、發色底物 和待測樣品構成的體系中，連續測定纖溶酶的生成引起的吸光度的變化以評定化合物的活 性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1為FG216菌絲的形態（400倍）示意圖。
[0020] 圖2為FG216菌株孢子形態圖（400倍）示意圖。
[0021] 圖3為菌株FG216的ITS - 5. 8S rDNA區域序列的系統發育樹示意圖。
[0022] 圖4為本發明菌株FG216的菌株FC216的ITS序列示意圖。
[0023] 圖5為本發明產溶活性化合物提取流程圖。
[0024] 圖6為本發明產溶活性化合物的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0025] 本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實 施例。
[0026] 實施例1
[0027] 1.菌種分離：含1%瓊脂的馬鈴薯蔗糖培養基，用海水配制，pH自然，121°C滅菌20 分鐘，例平板，冷卻后以200 μ 1的樣品量涂布每個平板，25°C培養5天。
[0028] 2.分離得到的單菌落保藏于馬鈴薯蔗糖斜面培養基。
[0029] 3.發酵培養基的制備：蔗糖50g，硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀0. lg，硫酸鎂0. 5g，氯 化鉀0. 5g，酵母提取物lg，氯化鈷0. 0025g，硫酸亞鐵0. 015g，氯化鈣0. 0065g，蒸餾水 lOOOmL，pH5. 8。
[0030] 4.菌株培養：培養溫度25*€，180rpm，培養3天后加入培養液體積1%的賴氨酸。 繼續培養2天。
[0031] 5.活性物質提取：加入等體積的純甲醇，超聲提取15分鐘，IOOOOrpm離心15分 鐘，上清液在40 - 60°C條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥。
[0032] 6. 96孔平板孔內注入纖溶酶原溶液、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑溶液、牛血清 白蛋白和發色底物溶液各1〇μ 1，其濃度分別為〇. l、〇. lmg/mL、500nmol/mL和Immol/mL，加 入樣品溶液10 μ 1后成50 μ 1反應體系。在37°C于405nm處連續150分鐘測定吸光度的變 化。吸光度值變化大，纖溶活性高。
[0033] 7.菌株FG216的發酵液具有促纖溶活性，纖溶活性隨著其代謝化合物的含量的增 加而增加。
[0034] 8.促纖溶活性化合物的純化：FG216發酵培養結束后，三角瓶中加入等體積的 100%的甲醇，超聲提取15min，在轉速IOOOOrpm的條件下離心15min，過濾，棄去沉淀，上清 液在40-60°C的條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥12h，殘留物溶于少量甲醇，過濾棄 去沉淀，收集上清液，再減壓濃縮，真空干燥，流程圖見圖5。所得殘留物溶于少量甲醇，用 于HPLC分離采用島津SCL-lOAvp HPLC分離系統，樣品在流速10mL/min，檢測波長265nm 的條件下被色譜柱S印ax HP-C18柱（21.2X250mm，10m)兩次精制，第一次流動相為甲 醇：0.05mol/L乙酸銨=80 : 20,第二次流動相為乙腈：0.1%甲酸=40 : 60,用S印ax HP-C18色譜柱（4. 6mmX 150mm，5m)鑒定所得化合物的純度。FGFCl的HPLC圖譜見圖6。
【權利要求】
1. 一種海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株，其特征在于，海洋微生物長孢葡萄穗霉菌株 (Stachybotrys longispora) FG216,，保藏號為 CCTCC :M2012227。
2. -種權利要求1海洋微生物菌株FG216產生的纖溶活性化合物，其特征在于，是通過 以下步驟制備的： 1) .菌種分離：含1%瓊脂的馬鈴薯蔗糖培養基，用海水配制，pH自然，121°C滅菌20分 鐘，例平板，冷卻后以200 μ 1的樣品量涂布每個平板，25°C培養5天后分離得到單菌。 2) .分離得到的單菌落保藏于馬鈴薯蔗糖斜面培養基。
3. 發酵培養基的制備：蔗糖50g，硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀0. lg，硫酸鎂0.5g，氯化 鉀〇. 5g，酵母提取物lg，氯化鈷0. 0025g，硫酸亞鐵0. 015g，氯化鈣0. 0065g，蒸餾水 lOOOmL，pH5. 8。
4. 菌株培養：培養溫度25°C，180rpm，培養3天后加入培養液體積1%的賴氨酸，繼續培 養2天。
5. 活性物質提取：加入等體積的純甲醇，超聲提取15分鐘，IOOOOrpm離心15分鐘，上 清液在40 - 60°C條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥。 6. 96孔平板孔內注入纖溶酶原溶液、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑溶液、牛血清白蛋 白和發色底物溶液各1〇μ 1，其濃度分別為〇. l、〇. lmg/mL、500nmol/mL和Immol/mL，加入樣 品溶液10 μ 1后成50 μ 1反應體系；在37°C于405nm處連續150分鐘測定吸光度的變化。
7. 促纖溶活性化合物的純化：FG216發酵培養結束后，三角瓶中加入等體積的100% 的甲醇，超聲提取15min，在轉速IOOOOrpm的條件下離心15min，過濾，棄去沉淀，上清液 在40-60°C的條件下減壓濃縮至干，濃縮物真空干燥12h，殘留物溶于少量甲醇，過濾棄去 沉淀，收集上清液，再減壓濃縮，真空干燥；所得殘留物溶于少量甲醇，用于HPLC分離采 用島津SCL-lOAvp HPLC分離系統，樣品在流速10mL/min，檢測波長265nm的條件下被色 譜柱S印ax HP-C18柱（21.2X250mm，10m)兩次精制，第一次流動相為甲醇：0.05mol/L 乙酸銨=80 : 20,第二次流動相為乙腈：0.1%甲酸=40 : 60,用S印ax HP-C18色譜柱 (4. 6mmX 150mm，5m)鑒定所得化合物的純度。
【文檔編號】C12N1/14GK104212721SQ201310655343
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】吳文惠, 包斌, 陳佳捷, 嚴婷, 孔婷, 蘇同偉, 張艷, 王幸 申請人:上海海洋大學