豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬葡萄球菌4種脫落毒素分型（EXHA、EXHB、EXHC和EXHD）的多重熒光PCR方法及試劑盒，屬于多重熒光PCR方法及試劑盒領域。本發明的方法采用了序列如SEQ?ID?NO:1-8所示的引物，還采用了序列如SEQ?ID?NO:9-12所示的Taqman探針。本發明還提供了豬葡萄球菌脫落毒素EXHA、EXHB、EXHC和EXHD多重熒光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含上述引物和Taqman探針，還包括DNA聚合酶；PCR緩沖液；dNTP和水。本發明的試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速、操作方便、節約耗材、成本低廉等優點，可用于豬葡萄球菌4種脫落毒素的檢測，用于科研及臨床應用。
【專利說明】豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測方法及試劑
盒【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多重熒光PCR方法及試劑盒，特別涉及一種豬葡萄球菌4種脫落毒素分型(EXHA、EXHB, EXHC和EXHD)的多重熒光PCR方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]葡萄球菌產生的脫落毒素可以引起人和動物發生嚴重的皮膚性疾病。例如金黃色葡萄球菌可引起人的燙傷樣皮膚綜合癥，豬葡萄球菌可引起仔豬發生滲出性皮炎。目前發現的脫落毒素有9種，包括金黃色葡萄球菌產生的ETA、ETB和ETD，以及豬葡萄球菌產生的EXHA、EXHB、EXHC和EXHD，還有日本研究人員發現的另外兩種豬葡萄球菌毒素蛋白SHETA和SHETB0
[0003]豬葡萄球菌(S.hyicus)可以引起豬群發生大規模的滲出性皮炎病(ExudativeEpidermitis，EE)，它是一種急性、高度接觸性的豬傳染病，患豬以急性全身性滲出性皮炎為主要特征，該病又稱溢脂性皮炎或煤煙病。本病主要感染5-6日齡的初生哺乳仔豬、剛斷奶的仔豬以及母豬乳房上。該病原可通過各種途徑感染，主要以破裂和損傷的皮膚黏膜引起動物的感染。據國內外的研究結果表明它的發病率為80% ;死亡率5%~90%不等；少數存活的病豬常導致生長發育障礙形成“僵豬”。
[0004]豬葡萄球菌所產生的這些脫落毒素是造成豬滲出性皮炎的主要致病因子之一，它是一種細胞外分泌的蛋白質，分子量大約30KD。丹麥研究者首先通過PCR和Western-blot對產生的脫落毒素進行了分析和研究，將脫落毒素分為4種類型，并分別命名為EXHA、EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3種毒素的抗原性。這4種脫落毒素的基因大小約為816bp~834bp，這些基因攜帶一些質粒，并受這些質粒的調控。
[0005]由于豬葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指紋型方面具有多型性(Andresenetal, 1993),發病豬中同時存在不同型的S.hyicus,從而使診斷變得復雜。Wegener發現從每個病豬的皮膚上任選分離出的10株S.hyicus中，平均包含1.9種不同的噬菌體型和2.3種不同的抗生素型。從動物肝、脾中分離到的菌株的多樣性則稍低一些。目前，在實驗室診斷中缺少簡易方法來區分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S.hicus都應被看做潛在的毒力型菌株。但是，由于引起該病的病因很復雜，而且易與其它皮膚病變混淆，如脂痘，疥癬，癬，玫瑰糖疹，缺鋅，增生性皮膚病等。因此，在診斷過程中要選擇特異性強、靈敏度高的檢測方法進行鑒別診斷。
[0006]目前，對豬葡萄球菌產生的脫落毒素采用的診斷方法主要是細菌學的分離鑒定、生化試驗、冰凍組織切片、免疫印跡分析、酶聯免疫(ELISA)、PCR和多重PCR方法等。
[0007]以上這些方法雖然已經得到了推廣應用，但是都存在耗費時間長、靈敏性和特異性欠佳等缺陷，對實際生產的指導意義不大。因此，建立一種快速、高效、準確的多重熒光PCR診斷方法已迫在眉睫。
【發明內容】
[0008]為克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測引物組，其中包括檢測EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組特異性引物和4條Taqman探針。
[0009]本發明的另目的在于提供包含上述檢測引物組的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測試劑盒，從而使檢測達到靈敏、快速、準確、節約材料和試劑的目的。
[0010]本發明的再一目的在于提供上述檢測試劑盒檢測豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR方法。
[0011]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測引物組，包括用于檢測EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針；
[0012]所述的4組引物為:
[0013]
【權利要求】
1.一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測引物組，其特征在于包括用于檢測EXHA、EXHB、EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針； 所述的4組引物如SEQ ID NO:1~8所示； 所述的Taqman探針由5’端帶有的突光物質，Taqman探針的序列和3’端帶有的淬滅物質組成； 所述的4條Taqman探針的序列如SEQ ID NO:9~12所示。
2.根據權 利要求1所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測引物組，其特征在于:所述的5’端帶有的熒光物質為FAM、J0E、TAMRA、Cy5中的至少一種； 所述的3’端帶有的淬滅物質為BHQ、BHQU BHQ2和BHQ3中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測引物組，其特征在于:所述的4條Taqman探針如下: EXHA-Prob-FAMFAM-tgaagcgccttttggagcagga-BHQ EXHB-Prob-JOEJOE-cacgccaatagagaatgtatcacatg- BH QI EXHC-Prob-TAMRA TAMRA-tggcagattaaatgttcaaggagaagc-BHQ2 EXHD-Prob-Cy5Cy5-cgttgctaccgcttcagttgtagga-BHQ3。
4.一種豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于包括權利要求I所述的檢測EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針。
5.根據權利要求4所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:試劑盒具有由以下成分組成:權利要求1所述的檢測EXHA、EXHB, EXHC及EXHD的4組引物和4條Taqman探針；DNA聚合酶；DNA聚合酶緩沖液；dNTP和水。
6.根據權利要求5所述的豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述的DNA聚合酶、DNA聚合酶緩沖液和dNTP為Premix Ex Taq試劑盒中的Premix溶液。
7.權利要求4~6任一項所述的檢測試劑盒檢測豬葡萄球菌脫落毒素分型的多重熒光PCR方法，具體步驟如下: (1)提取待測樣品的DNA|旲板； (2)配制PCR反應體系:步驟(1)待測樣品DNA模板2μ L ;4組引物中各條引物的量為5-15pmol ;4條Taqman探針中各種探針的量為2_10pmol ;Premix溶液10 μ L,加水至總體積為 20 μ L ; (3)將上述步驟(2)中配制的PCR反應體系置于熒光定量PCR儀中反應，反應條件如下:95°C 30秒；熱循環為95°C I秒，60°C 20秒，共40個循環； (4)通過熒光探針上所攜帶的熒光染料的顏色對應的擴增曲線的CT值判斷，是否存在EXHA、EXHB、EXHC及EXHD，及存在的量的多少。
【文檔編號】C12N15/11GK103667479SQ201310655300
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】宋長緒, 蔣智勇, 張樂宜, 蔡汝健, 李艷, 劉燕玲 申請人:廣東省農業科學院動物衛生研究所