一種茶樹rna提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種茶樹RNA提取方法，步驟包括：取茶樹組織，加入不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP，液氮研磨成粉末，加入提取液，水浴并離心，獲得的上清液中加入無水乙醇，沉淀RNA，再用吸附柱進行吸附，洗滌吸附柱，最后用RNA-free水洗脫，獲得茶樹RNA。該方法是將現有技術的CTAB法與RNA提取試劑盒結合，在現有茶樹RNA提取方法上做了進一步優化，與現有技術相比，該方法提取茶樹RNA的時間短，獲得的茶樹RNA的提取率和純度高。
【專利說明】—種茶樹RNA提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及RNA提取領域，具體地是一種茶樹RNA提取方法。
【背景技術】
[0002]茶樹原產于我國西南地區，是一種喜溫畏寒的多年生經濟作物，從分子水平上挖掘優良茶樹種質資源是一項很有意義的工作。隨著現代分子生物學的發展，構建茶樹cDNA文庫、茶樹基因克隆及表達分析、茶樹microRNA分析等已經成為茶樹生物技術研究的重點工作，而從茶樹中提取出高質量的RNA是進行這些研究的關鍵步驟。
[0003]茶樹是一種的多年生木本植物，富含多糖、多酚類物質，容易在核酸分離純化時，與RNA相互作用，使得RNA降解，因此，用這些常規方法提取時往往效果較差。現有技術中常用的RNA提取方法包括CTAB法、TriZ01法等，也有很多市售的RNA提取試劑盒，如史成穎等人利用傳統CTAB法，提取獲得了茶樹嫩葉RNA(史成穎等，提取高質量茶樹總RNA的方法研究，安徽農業大學學報，2007年，第34期第3版，360~363頁)，該茶樹RNA的A260/280值為2.08~2.10，RNA濃度為845.5~901.2ng/μ L，提取過程消耗了 2天的時間。市售的植物RNA提取試劑盒種類較多，提取時間短，一般只需要2~4小時，但針對性不強，提取率和純度不能很好地滿足開展茶樹基因工程實驗需要。因此，需要尋找一種更加優化的方法，以達到進一步提高 總RNA提取率的基礎上縮短提取時間，同時保證RNA的高純度及完整性的目的。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種茶樹RNA提取方法，以提供一種更加優化的方法，進一步提高茶樹RNA提取率和純度，縮短提取時間。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟:
[0006]一種茶樹RNA提取方法，包括以下步驟:
[0007](I)取茶樹組織，加入茶樹組織0.5~1.5倍重量的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP，液氮中研磨成粉末；
[0008](2)將步驟(1)的粉末中加入提取液，每Ig茶樹組織加入4.5mL的提取液，混勻，每Ig茶樹組織中再加入250μ L的β-巰基乙醇，水浴，得到粗樣品；
[0009](3)將步驟(2)的粗樣品在4°C下離心，取上清轉移至RNA提取試劑盒的過濾柱中，離心，獲得上清液；
[0010](4)將步驟(3)的上清液中加入0.5倍上清液體積的無水乙醇，混勻，獲得粗提液；
[0011](5)將步驟(4)的粗提液轉移至RNA提取試劑盒的吸附柱中進行吸附，然后用RNA提取試劑盒中的去蛋白液和漂洗液洗滌吸附柱，最后用不含核酸酶的RNA-free水洗脫吸附柱上的RNA，獲得茶樹RNA。
[0012]優選地，所述步驟(1)中，茶樹組織選自茶樹嫩葉、成熟葉、茶樹嫩根和茶樹花蕾中的一種。[0013]優選地，所述步驟(1)中，加入的PVPP重量與茶樹組織的重量相等。
[0014]優選地，所述步驟(2)中，水浴溫度為65°C，水浴時間為30min。
[0015]優選地，所述步驟(2)中，提取液的配方為:1.4mol/L的NaCl，重量百分比為2%的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，IOOmmoI/L的三羥甲基氨基甲烷的鹽酸溶液Tris-HCl和20mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA，溶劑為焦碳酸二乙酯DEPC水，pH8.0,配制后滅菌。
[0016]優選地,所述步驟(3)中，離心的轉速為12000rpm,離心的時間為5min,將粗樣品離心可以去除粗樣品中的固體物質，避免后續將樣品轉入過濾柱時，固體物質堵塞過濾柱。
[0017]本發明相比現有技術具有以下優點:本發明提供了一種茶樹RNA提取方法，該方法是將現有技術的CTAB法與RNA提取試劑盒結合，在現有茶樹RNA提取方法上做了進一步優化，用該方法提取茶樹RNA的用時只需2小時，大大縮短了提取時間，同時，用該方法提取茶樹RNA與現有技術相比，茶樹RNA的提取率和純度都有大幅度提高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為茶樹嫩葉RNA的甲醛變性膠電泳圖，其中泳道I~3為3個重復；
[0019]圖2為茶樹成熟葉片RNA的甲醛變性膠電泳圖，其中泳道I~2為2個重復；
[0020]圖3為茶樹嫩根中RNA的甲醛變性膠電泳圖，其中泳道I~3為3個重復；
[0021 ] 圖4為茶樹花蕾RNA的甲醛變性膠電泳圖，其中泳道I~3為3個重復；
[0022]圖5為用試劑盒提取的茶樹嫩葉RNA的甲醛變性膠電泳圖，其中I~2為2個重復。
【具體實施方式】
[0023]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0024]實施例1
[0025]本實施例為茶樹嫩葉RNA提取方法，包括以下步驟:
[0026](I)取茶樹嫩葉0.2g,加入0.2g的不溶性聚乙烯吡咯烷酮，液氮中迅速研磨成粉末；
[0027](2)配制提取液并滅菌，將步驟(1)的粉末中加入900 μ L的提取液，混勻，再加入50 μ L的β -巰基乙醇，65°C下水浴30min，得到粗樣品，所述提取液的配方為:1.4mol/L的NaCl，重量百分比為2%的十六烷基三甲基溴化銨，IOOmmoI/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA，溶劑為水；
[0028](3)將步驟(2)的粗樣品在4°C下離心5min,離心轉速為12000rpm,取上清轉移至天根RNA提取試劑盒(購于天根生化科技有限公司)的過濾柱CS中，12000rpm離心2min,獲
得上清液；
[0029](4)將步驟(3)的上清液中加入0.5倍上清液體積的無水乙醇，混勻，獲得粗提液；
[0030](5)將步驟(4)的粗提液用天根RNA提取試劑盒提取，所述提取步驟包括:
[0031]I)將粗提液轉移至試劑盒的帶有收集管的吸附柱CR3中進行吸附，12000rpm離心lmin，棄廢液，將吸附柱CR3重新放回收集管中；[0032]2)向上述步驟I)的吸附柱CR3中加入350 μ L去蛋白液RWl溶液，12000rpm離心lmin，棄廢液，將吸附柱CR3重新放回收集管中；
[0033]3)配制DNase I溶液:取10 μ L的DNase I的存儲液，加入70 μ L的RDD溶液混勻；
[0034]4)向上述步驟2)的吸附柱CR3中加入80 μ L的DNase I溶液，室溫放置15min，然后加入350 μ L的去蛋白液RWl溶液，12000rpm下離心lmin，棄廢液，將CR3重新放回收
集管中；
[0035]5)向上述步驟4)的吸附柱CR3中加入500 μ L的漂洗液RW (使用前已按試劑盒說明書中的提示加入無水乙醇)，室溫靜置2min，12000rpm下離心lmin，棄廢液，將CR3重新放回收集管中；
[0036]6)重復上述步驟5),在12000rpm下離心2min,棄廢液,將吸附柱CR3于室溫下靜置10分鐘以徹底晾干吸附柱中殘留的漂洗液
[0037]7)將上述步驟6)的吸附柱CR3放入一個新的離心管中，向吸附膜中懸空滴加50 μ L不含核酸酶的RNA-free水，室溫放置2min，12000rpm下離心2min，得到得溶液即為RNA。得到的所述總RNA。
[0038]以上提取方法中所用到的試劑和實驗器材均不含核酸酶，重復3次，提取獲得的RNA甲醛變性膠電泳結果如圖1所示。
[0039]實施例2
[0040]本實施例為茶樹成熟葉的RNA提取方法，取茶樹成熟葉0.2g，剪碎，加入0.2g的PVPP，其它步驟同實施例1，重復2次，提取獲得的RNA甲醛變性膠電泳結果如圖2所示。
[0041]實施例3
[0042]本實施例為茶樹嫩根的RNA提取方法，取茶樹嫩根0.2g，剪碎，加入0.2g的PVPP，其它步驟同實施例1，重復3次，提取獲得的RNA甲醛變性膠電泳結果如圖3所示。
[0043]實施例4
[0044]本實施例為茶樹花蕾的RNA提取方法，取茶樹花蕾0.2g，加入0.2g的PVPP，其它步驟同實施例1，重復3次，提取獲得的RNA甲醛變性膠電泳結果如圖4所示。
[0045]取實施例1~4提取的茶樹RNA，用甲醛變性膠進行電泳檢測，獲得如圖1~4所示的電泳圖，另取茶樹嫩葉，用天根RNA提取試劑盒提取RNA作為對照組，重復2次，得到如圖5所示的甲醛變性膠電泳圖。
[0046]通過核酸定量儀檢測實施例1~4提取的茶樹RNA和對照組的RNA的A260/280值和RNA濃度，計算RNA平均濃度，結果如下表1所示:
[0047]表1:茶樹RNA的A260/280值和提取率的測定結果
【權利要求】
1.一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取茶樹組織，加入茶樹組織0.5~1.5倍重量的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP，液氮中研磨成粉末； (2)將步驟(1)的粉末中加入提取液，每Ig茶樹組織加入4.5mL的提取液，混勻，每Ig茶樹組織中再加入250yL的β-巰基乙醇，水浴，得到粗樣品； (3)將步驟(2)的粗樣品在4°C下離心，取上清轉移至RNA提取試劑盒的過濾柱中，離心，獲得上清液； (4)將步驟(3)的上清液中加入0.5倍上清液體積的無水乙醇，混勻，獲得粗提液； (5)將步驟(4)的粗提液轉移至RNA提取試劑盒的吸附柱中進行吸附，然后用RNA提取試劑盒中的去蛋白液和漂洗液洗滌吸附柱，最后用不含核酸酶的RNA-free水洗脫吸附柱上的RNA，獲得茶樹RNA。
2.如權利要求1所述的一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中，茶樹組織選自茶樹嫩葉、成熟葉、茶樹嫩根和茶樹花蕾中的一種。
3.如權利要求1所述的一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中，加入的PVPP重量與茶樹組織的重量相等。
4.如權利要求1所述的一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中，水浴溫度為65°C，水浴時間為30min。
5.如權利要求1所述的一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中，提取液的配方為:1.4mol/L的NaCl，重量百分比為2%的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，IOOmmoI/L的三羥甲基氨基甲烷的鹽酸溶液Tris-HCl和20mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA，溶劑為焦碳酸二乙酯DEPC水，pH8.0,配制后滅菌。
6.如權利要求1所述的一種茶樹RNA提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中，離心的轉速為12000rpm,離心的時間為5min。
【文檔編號】C12N15/10GK103667259SQ201310654955
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】李葉云, 添先鳳, 周月琴, 江昌俊 申請人:安徽農業大學