一種人表皮生長因子的制備和純化方法

一種人表皮生長因子的制備和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人表皮生長因子的制備和純化方法，包括構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ1.1myc-His6、構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF、重組質(zhì)粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和hEGF蛋白的分泌和純化的步驟。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)，構(gòu)建了微生物表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF，再將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)至表達(dá)量高，易于純化以及容易適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的CHO細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定的高分泌型工程菌，實現(xiàn)人表皮生長因子的生產(chǎn)。表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近天然的生物蛋白質(zhì)分子，經(jīng)過Balb/c3t3細(xì)胞的活性測定實驗顯示與標(biāo)準(zhǔn)品相比具有較高生物學(xué)活性，可達(dá)到1×105U/mg。
【專利說明】一種人表皮生長因子的制備和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種人表皮生長因子的制備和純化方法。。
【背景技術(shù)】
[0002]人表皮生長因子(Human Epidermal Growth Factor,簡稱hEGF)是一種含有53個氨基酸的單鏈多肽，分子量為6216道爾頓。hEGF是一種多功能細(xì)胞生長因子，通過與細(xì)胞膜上hEGF受體結(jié)合發(fā)揮生理作用。研究表明:表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上都含有hEGF受體，其中表皮細(xì)胞含量最高。hEGF接近細(xì)胞后與細(xì)胞膜上的hEGEF受體結(jié)合，促使細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生一系列復(fù)雜的生化級聯(lián)反應(yīng)，使得RNA、DNA和蛋白質(zhì)合成增加，最終促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖，加速細(xì)胞新陳代謝。
[0003]人的尿液、血液、乳汁及胃液等含有的內(nèi)源性hEGF很少，并且為與受體結(jié)合的生理狀態(tài)，從生物來源中提取hEGF比較困難，僅僅限于理論研究。目前生產(chǎn)hEGF主要有2種途徑:一種是化學(xué)合成法，雖然產(chǎn)物純度高但是產(chǎn)率不高，而且蛋白質(zhì)不能像生物合成一樣折疊，無法工業(yè)化生產(chǎn)。另一種方法是采用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)hEGF?；蛑亟MhEGF的基本策略是首先從制備hEGF目的基因，然后將目的基因連接至表達(dá)載體上，從而構(gòu)建出含hEGF目的基因的重組質(zhì)粒，最后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因工程菌中表達(dá)，分離純化得到hEGF目的蛋白。目前表達(dá)載體主要有大腸桿菌和酵母菌，hEGF在這兩種表達(dá)載體中的表達(dá)量小，發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度低，提取和純化工藝復(fù)雜，而且所獲得的hEGF活性不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供提供一種高效、穩(wěn)定的表達(dá)hEGF工程菌的構(gòu)建、篩選，以及分離純化目的蛋白hEGF的方法，解決重組人表皮生長因子在哺乳動物細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)中分泌表達(dá)的問題。
[0005]一種人表皮生長因子的制備和純化方法，其特征在于，包括以下步驟:
(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6:
提取質(zhì)粒pcDNA3.l(+)/myc-His A，經(jīng)限制性內(nèi)切酶汝./ II和I雙酶切處理，得到3392bp的片段；
提取質(zhì)粒pSecTag2 A，經(jīng)限制性內(nèi)切酶汝./ II和泣? I雙酶切處理，得到2186bp的片
段；
將3392bp片段與2186bp片段以體積比2:3的比例用連接酶連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶汝./ II和泣? I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6 ；
(b)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF:
提取重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6，經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和沿ο I酶切，得到5525bp的片段，酶切產(chǎn)物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理；
提取含hEGF基因片段的質(zhì)粒pMD18-T-His6-SUM0-hEGF，經(jīng)限制性內(nèi)切酶漢挪H I和沿οI酶切得到486bp的hEGF基因片段；
將5525bp片段與486bp片段以體積比1:4的比例用連接酶進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶I和沿ο I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF ；
(c)重組質(zhì)粒pBSAZ1.1 myc-His6-SUM0-hEGF轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞:在轉(zhuǎn)染試劑存在下將重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代直至得到穩(wěn)定細(xì)胞株；
(d)hEGF蛋白的分泌和純化:將轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細(xì)胞株于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集含有分泌的目的蛋白培養(yǎng)基，離心取上清液；親和層析，用清洗液除去雜蛋白后，加入洗脫液將hEGF洗脫，收集唯一的洗脫峰即為目的蛋白；將含有目的蛋白的樣品緩慢加入N1-NTA柱，先用破菌緩沖液洗5個柱體積，再用PBS緩沖液洗3個柱體積；最后加入SUMO特異性切割酶Ulpl室溫反應(yīng)10-30分鐘或4°C下2-6小時；用PBS洗脫酶切下來的hEGF，收集流出液。
[0006]步驟c中所述的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)方法為:100mm的培養(yǎng)皿中以3X IO6個細(xì)胞的濃度接種CHO細(xì)胞，培養(yǎng)基為含5%的小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培養(yǎng)基，37°C置于恒溫培養(yǎng)箱，5%C02培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時要求80%-90%細(xì)胞匯
合
[0007]步驟c中的轉(zhuǎn)染方法具體為:分別把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF質(zhì)粒和12ul的轉(zhuǎn)染試劑稀釋到200ul無血清培養(yǎng)基中，室溫放置五分鐘再混合，將混合液在室溫放置10 — 15分鐘后滴入CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4h后換液，繼續(xù)篩選培養(yǎng)24-48小時得到陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代直至得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0008]步驟d中所述的清洗液含有 20mmol/L咪唑,300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2P04,pH值為8.0。
[0009]步驟d 中所述的洗脫液含有 250mmol/L 咪唑,300mmol/L NaCl, 150 mmol/LNaH2PO4, pH 值為 8.0。
[0010]步驟d中所述SUMO特異性切割酶Ulpl由以下方法制備得到:
(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Ulpl:提取含Ulpl基因片段的質(zhì)粒pMD18-T_Ulpl，經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和通ο I酶切得到Ulpl基因片段；與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a連接得到 pET-28a-Ulpl ；
(b)構(gòu)建重組菌株BL21/pET-28a-Ulpl:將重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl加入感受態(tài)細(xì)胞BL21，冰上放置30分鐘，然后42°C水浴中熱激90-120秒，冰上放置2_3分鐘，涂布含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，置37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；
(c)Ulpl的誘導(dǎo)表達(dá)及純化:挑取重組菌株BL21/pET-28a-Ulpl單克隆于含卡納青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，待0D_值0.6-0.8時加入IPTG至終濃度0.2mM,22°C誘導(dǎo)過夜；離心收菌，用破菌緩沖液重懸沉淀，加入PMSF，超聲波破菌；細(xì)菌破碎液離心，取上清；上N1-NTA柱純化，N1-NTA洗脫下來了的蛋白用FPLC進(jìn)一步純化。
[0011]本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)，構(gòu)建了微生物表達(dá)載體重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1myc-His6-SUM0-hEGF,再將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)至表達(dá)量高，易于純化以及容易適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)，構(gòu)建穩(wěn)定的高分泌型工程菌，實現(xiàn)人表皮生長因子的生產(chǎn)。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能方面最接近天然的生物蛋白質(zhì)分子。胞外分泌型表達(dá)是目前最先進(jìn)的且適于工業(yè)化的表達(dá)方式，細(xì)胞外表達(dá)可以避免蛋白在保內(nèi)聚集形成包涵體，使目的蛋白的下游純化更加簡單，利于大規(guī)模處理。
[0012]通過本發(fā)明的方法得到的hEGF，經(jīng)過Balb/c 3t3細(xì)胞的活性測定實驗顯示與標(biāo)準(zhǔn)品相比具有較高生物學(xué)活性，可達(dá)到I X 105u/mg。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是重組質(zhì)粒pET-28a-Ulpl構(gòu)建不意圖。
[0014]圖2是重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和沿ο I雙酶切驗證電泳圖。
[0015]圖3是重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc_His6構(gòu)建示意圖。
[0016]圖4是重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc_His6經(jīng)限制性內(nèi)切酶奴7 II和汾? I雙酶切驗證電泳圖。
[0017]圖5 是重組質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 構(gòu)建示意圖。
[0018]圖6是重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和ZAoI雙酶切驗證電泳圖。
[0019]圖7是hEGF蛋白純化SDS-PAGE蛋白電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1:重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl的構(gòu)建 一)試驗材料
(I)質(zhì)粒和菌株
質(zhì)粒pET-28a和大腸桿菌JM109購自Takara生物科技有限公司。
[0021](2)試劑
限制性內(nèi)切酶Ue 1和通0 I,卡納青霉素購自NEB公司。去磷酸化酶購自Takara生物科技有限公司。
[0022](3)基因片段 Ulpl由華大基因合成。
[0023]二)實施方案
1.質(zhì)粒pET-28a的酶切
大量提取重構(gòu)質(zhì)粒pET-28a，純化后加入限制性內(nèi)切酶I和ZAo I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱l_4h做雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理，將去磷酸化產(chǎn)物純化后置4°C冰箱保存待用。
[0024]2.Ulpl基因片段的獲得
大量提取含Ulpl基因片段的質(zhì)粒pMD18-T-Ulpl，純化后加入限制性內(nèi)切酶I和Xho I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱l_4h做雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收729bp片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0025]3.重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl的構(gòu)建
重組質(zhì)粒pET-28a-Ulpl構(gòu)建示意圖如圖1所示。[0026]將步驟I和步驟2中4°C冰箱保存的基因片段按照以下配比加連接酶進(jìn)行連接處理:線性化 pET-28a I μ L ；Ulpl 基因片段 4 μ L ;連接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；BufferI μ Lo
[0027]將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過卡納青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶I和ZA0 I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pET-28a-Ulpl。重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和通ο I雙酶切驗證電泳圖如圖2所示。
[0028]實施例2:重組菌株BL21/pET-28a_Ulpl的構(gòu)建 一)試驗材料
(I)菌株
大腸桿菌BL21(DE3)購自Takara生物科技有限公司。
[0029](2)試劑
卡納青霉素購自NEB公司。
[0030]二)實施方案
1.質(zhì)粒pET-28a-Ulpl的提取
大量提取重構(gòu)質(zhì)粒pET-28a-Ulpl，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0031]2.轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞
感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)從_70°C取出`，放在冰上1_5分鐘使其融化，在超凈臺中取pET-28a-Ulpl質(zhì)粒0.5-lul加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置15-30分鐘，然后42°C水浴中熱激90-120秒，冰上放置1-3分鐘，涂布含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，置37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
[0032]實施例3.=Ulpl的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
一)試驗材料
(I)試劑
卡納青霉素、IPTG購自NEB公司。
[0033]二)實施方案 1.Ulpl的誘導(dǎo)表達(dá)
挑取單克隆于IOml含卡納青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按1:100比例轉(zhuǎn)接到新的IL含卡納青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)約2_3小時，待OD600值0.2-1.2時加入IPTG至終濃度0.2mM, 22°C誘導(dǎo)過夜。
[0034]2.Ulpl 的純化
5000rpml5分鐘離心收菌，棄上清倒置I分鐘使殘余培養(yǎng)基流盡。用破菌緩沖液(50mMNaH2P04,500mM NaCl，pH8.0)重懸沉淀，5000rpml0分鐘離心收菌，棄上清。取50ml破菌緩沖液加入到沉淀中并吹打均勻，1:200加入苯甲基磺酰氟PMSF，超聲波破菌5-15分鐘，至半透明。細(xì)菌破碎液15000rpml5分鐘離心，取上清。上N1-NTA柱純化，樣品緩慢滴下使蛋白更好地與柱子結(jié)合。上樣完畢，先用破菌緩沖液洗5個柱體積，再用梯度洗脫緩沖液(50mMNaH2PO4, 500mM NaCl,250mM 咪唑，pH8.0)洗脫，15% SDS-PAGE 檢測蛋白洗脫情況。N1-NTA洗脫下來了的蛋白用快速蛋白液相色譜FPLC進(jìn)一步純化。
[0035]實施例4:重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc_His6的構(gòu)建一)試驗材料 (I)質(zhì)粒和菌株
質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His A由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)系鄭學(xué)明教授惠贈；質(zhì)粒pSecTag2 A購自Invitrogen公司；大腸桿菌JM109購自Takara生物科技有限公司。
[0036]⑵引物
限制性內(nèi)切酶汝./ II和I購自NEB公司；
二)實施方案
1.質(zhì)粒 pcDNA3.1/mys-His 的酶切
將質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) /myc-His A電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài),接種陽性轉(zhuǎn)化子37°C搖床過夜培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒純化，加限制性內(nèi)切酶汝./ II和I置于37°C恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行雙酶切處理，將處理產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收3392bp的片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0037]2.質(zhì)粒 pSecTag2 A 的酶切
將質(zhì)粒pSecTag2 A電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)，接種陽性轉(zhuǎn)化子37°C搖床過夜培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒純化，加限制性內(nèi)切酶ife./ II和I置于37°C恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行雙酶切處理，將處理產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收2186bp的片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0038]3.重組質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc_His6 的構(gòu)建
重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6構(gòu)建示意圖如圖3所示。
[0039]將步驟I和步驟2中得到的片段按照以下配比加連接酶進(jìn)行連接處理:3392bp的片段 2 μ L ；2186bp 的片段 3 μ L ;連接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；Buffer I μ L。將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶汝./ II和泣? I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6。重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6經(jīng)限制性內(nèi)切酶汝./ II和I雙酶切驗證電泳圖如圖4所示。
[0040]實施例5:重組質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 的構(gòu)建
一)試驗材料
(I)質(zhì)粒和菌株
大腸桿菌JM109購自Takara生物科技有限公司。
[0041](2)試劑
限制性內(nèi)切酶I和通ο I購自NEB公司。去磷酸化酶購自Takara生物科技有限公司。
[0042](3)基因片段 hEGF由華大基因合成。
[0043]二)實施方案
1.質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc_His6 的酶切
大量提取重構(gòu)質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6，純化后加入限制性內(nèi)切酶SaMl I和ZAo I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱l_4h做雙酶切處理，得5525bp的片段。將酶切產(chǎn)物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理，將去磷酸化產(chǎn)物純化后置4°C冰箱保存待用。[0044]2.hEGF基因片段的獲得
大量提取含hEGF基因片段的質(zhì)粒PMD18-T-His6-SUM0-hEGF，純化后加入限制性內(nèi)切酶腦H I和通ο I，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱l_4h做雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收486bp片段，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0045]3.重組質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 的構(gòu)建
重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF構(gòu)建示意圖如圖5所示。
[0046]I步驟和2步驟中所得的4°C冰箱保存的基因片段按照以下配比加連接酶進(jìn)行連接處理:5525bp 的片段 I μ L ；486bp 的片段 4 μ L ;連接酶 0.5 μ L ；dd H2O 3.5 μ L ；BufferI μ Lo
[0047]將連接產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶I和通ο I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF。
[0048]重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF經(jīng)限制性內(nèi)切酶漢猜H I和ZAo I雙酶切驗證電泳圖如圖6所示。
[0049]實施例6:重組質(zhì)粒 pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0_hEGF 轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞
一)試驗材料
(I)質(zhì)粒和菌株` 中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)由上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院吳方老師惠贈。
[0050](2)試劑
G418購自購自Invitrogen公司；
二)實施方案
1.重組質(zhì)粒提取
大量提取重構(gòu)質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF，純化后置4°C冰箱保存待用。
[0051]2.CHO細(xì)胞的培養(yǎng)
IOOmm的培養(yǎng)皿中以3X IO6個細(xì)胞的濃度接種CHO細(xì)胞，培養(yǎng)基為含5%的小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前一天加入7ml培養(yǎng)基(含血清，不含抗生素)，37°C置于恒溫培養(yǎng)箱，5%C02培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時要求80%-90%細(xì)胞匯合。
[0052]3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞
分別把 l_6ug 的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF質(zhì)粒和 3-18ul 的轉(zhuǎn)染試劑Polyjet?稀釋到200ul無血清培養(yǎng)基中，室溫放置5-10分鐘再混合，將混合液在室溫放置5-15分鐘后滴入CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-7h后換液(G418+培養(yǎng)基)，繼續(xù)篩選培養(yǎng)24-48小時得到陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代直至得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0053]實施例7:hEGF蛋白的純化
收集含有分泌的目的蛋白培養(yǎng)基，離心去除不容性的雜質(zhì)，取上清。上清液利用AKTA purifier 100系統(tǒng)經(jīng)過His Trap? FF crude親和層析,用清洗液(20mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, pH8.0)洗去雜蛋白，再用洗脫液(250mmol/L 咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4,pH8.0)洗脫，收集唯一的洗脫峰即為目的蛋白。含有目的蛋白的樣品緩慢加入N1-NTA柱，使蛋白更好地與柱子結(jié)合。上樣完畢，先用破菌緩沖液洗 5 個柱體積，再用 PBS (pH7.3,140 mM NaCl, 2.7mM NaCl，50 mM NaH2PO4)洗 3 個柱體積。向結(jié)合有 Ig kappa-chain-His6-SUM0-hEGF 蛋白的 N1-NTA 柱中加入 0.1mg 的 SUMO 特異性切割酶Ulpl室溫反應(yīng)半小時或4°C下2-6小時。酶切下來的hEGF用PBS洗脫下來，收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。
[0054]過柱純化的hEGF蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，最后在凝膠成像儀上成像，得到結(jié)果如圖7所示。
[0055]實施例8 =MTT法測定hEGF蛋白的活性 一)試驗材料
1.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Balb/c 3t3細(xì)胞)購自ATCC。
[0056]2.試劑:
①RPMI 1640培養(yǎng)基1000ml加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加NaHCO3 2.lg，溶解后，混勻，除菌過濾，4度保存
@維持培養(yǎng)液牛血清4ml加RPMI1640 1000ml ；
@完全培養(yǎng)液牛血清100mL加RPMI1640 1000ml ；
④ PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO3 1.44g KH2PO3 0.24g 加水至 1000ml 經(jīng) 121度15分鐘滅菌；
C'噻唑藍(lán)(MTT)溶液取MTT粉末0.1g加PBS20ml溶解，經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾除菌，
4度避光保存。
[0057]二)實施方案`
1.取重組人表皮生長因子標(biāo)準(zhǔn)品按說明書復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋至每1ml含50IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個控。無菌操作；
2.取樣品復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個控。無菌操作；
Balb/c 3t3細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37度，5%C02培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每1ml含
1.0X 105-5.0X IO5個細(xì)胞，傳代后24-36h用于生物活性測定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成每1ml含5.0X 104-8.0X IO4個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ I。在37度，5%C02培養(yǎng)培養(yǎng)15_24h。制備的細(xì)胞培養(yǎng)板棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，每孔100 μ I。于37度，5%C02培養(yǎng)60-72h。每孔加入MTT溶液20 μ 1，于37度，5%C02培養(yǎng)2_8h。以上操作在無菌條件下進(jìn)行。棄去培養(yǎng)液中的液體后，向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO) 100 μ 1，混勻后在酶標(biāo)儀上，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。
[0058]Balb/c 3t3細(xì)胞的活性測定實驗顯示與標(biāo)準(zhǔn)品相比hEGF樣品具有較高生物學(xué)活性，檢測到hEGF樣品的活性為I X 105U/mg。
[0059]本【技術(shù)領(lǐng)域】中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，以上的實施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非作為對本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種人表皮生長因子的制備和純化方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6: 提取質(zhì)粒pcDNA3.l(+)/myc-His A，經(jīng)限制性內(nèi)切酶汝./ II和I雙酶切處理，得到3392bp的片段； 提取質(zhì)粒pSecTag2 A，經(jīng)限制性內(nèi)切酶汝./ II和泣? I雙酶切處理，得到2186bp的片段； 將3392bp片段與2186bp片段以體積比2:3的比例用連接酶連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶汝./ II和泣? I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6 ； (b)構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF: 提取重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6，經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和沿ο I酶切，得到5525bp的片段，酶切產(chǎn)物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理； 提取含hEGF基因片段的質(zhì)粒pMD18-T-His6-SUM0-hEGF，經(jīng)限制性內(nèi)切酶漢挪H I和沿οI酶切得到486bp的hEGF基因片段； 將5525bp片段與486bp片段以體積比1:4的比例用連接酶進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶I和沿ο I雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF ；
(c)重組質(zhì)粒pBSAZ1.1 myc-His6-SUM0-hEGF轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞:在轉(zhuǎn)染試劑存在下將重組質(zhì)粒pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代直至得到穩(wěn)定細(xì)胞株； (d)hEGF蛋白的分泌和純化:將轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細(xì)胞株于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集含有分泌的目的蛋白培養(yǎng)基，離心取上清液；親和層析，用清洗液除去雜蛋白后，加入洗脫液將hEGF洗脫，收集唯一的洗脫峰即為目的蛋白；將含有目的蛋白的樣品緩慢加入N1-NTA柱，先用破菌緩沖液洗5個柱體積，再用PBS緩沖液洗3個柱體積；最后加入SUMO特異性切割酶Ulpl室溫反應(yīng)10-30分鐘或4°C下2-6小時；用PBS洗脫酶切下來的hEGF，收集流出液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中所述的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)方法為:IOOmm的培養(yǎng)皿中以3X IO6個細(xì)胞的濃度接種CHO細(xì)胞，培養(yǎng)基為含5%的小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前一天加入7ml含血清，不含抗生素的培養(yǎng)基，37°C置于恒溫培養(yǎng)箱，5%C02培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時要求80%-90%細(xì)胞匯合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中的轉(zhuǎn)染方法具體為:分別把4ug的pBSAZ 1.1 myc-His6-SUM0-hEGF質(zhì)粒和12ul的轉(zhuǎn)染試劑稀釋到200ul無血清培養(yǎng)基中，室溫放置五分鐘再混合，將混合液在室溫放置10 — 15分鐘后滴入CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4h后換液，繼續(xù)篩選培養(yǎng)24-48小時得到陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子連續(xù)傳代直至得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中所述的清洗液含有20mmol/L咪唑，300mmol/L NaC, 150 mmol/L NaH2P04, pH 值為 8.0。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d中所述的洗脫液含有250mmol/L咪唑，300mmol/L NaCl, 150 mmol/L NaH2PO4, pH 值為 8.0。
6.如權(quán)利要求1所述的方法 ，其特征在于，步驟d中所述SUMO特異性切割酶Ulpl由以下方法制備得到: (a)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Ulpl:提取含Ulpl基因片段的質(zhì)粒pMD18-T_Ulpl，經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和通ο I酶切得到Ulpl基因片段；與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a連接得到 pET-28a-Ulpl ； (b)構(gòu)建重組菌株BL21/pET-28a-Ulpl:將重組質(zhì)粒pET-28a_Ulpl加入感受態(tài)細(xì)胞BL21，冰上放置30分鐘，然后42 °C水浴中熱激90-120秒，冰上放置2_3分鐘，涂布含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，置37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)； (c)Ulpl的誘導(dǎo)表達(dá)及純化:挑取重組菌株BL21/pET-28a-Ulpl單克隆于含卡納青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，待OD_值0.6-0.8時加入IPTG至終濃度0.2mM,22°C誘導(dǎo)過夜；離心收菌，用破菌緩沖液重懸沉淀，加入PMSF，超聲波破菌；細(xì)菌破碎液離心，取上清；上N1-NTA柱純化，N1`-NTA洗脫下來了的蛋白用FPLC進(jìn)一步純化。
【文檔編號】C12N15/85GK103882055SQ201310651408
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】王喆明, 鄭學(xué)明, 張宏波, 馬經(jīng)緯 申請人:杭州拜善晟生物科技有限公司