鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，包括如下步驟：（1）粗酶液的制備；（2）離子交換層析；（3）凝膠過濾。本發(fā)明方法特異性高，工藝簡單，蛋白質(zhì)不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是一種鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鏈霉菌，其基內(nèi)菌絲多分枝，一般橫隔稀疏，很少斷裂，常產(chǎn)生各種水溶性或脂溶性的色素；氣生菌絲比基內(nèi)菌絲稍粗，為外鞘所包，氣生菌絲部分分化成直形、柔曲、鉤環(huán)狀至松敞或緊密螺旋形的孢子絲，時(shí)常含50個(gè)左右的孢子，短者含5~10個(gè)孢子；孢子為節(jié)孢子，由菌絲斷裂而成，有的脫去外鞘，有的攜帶外鞘或殘余，外鞘決定孢子的表面結(jié)構(gòu)；DNA中的G+C克分子含量為69~76%，因許多種是抗生素的產(chǎn)生菌而且產(chǎn)生抗生素的種類最多而著名(如鏈霉素)。
[0003]幾丁質(zhì)酶作為一種抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要機(jī)制之一。合適的培養(yǎng)方法與微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶密切相關(guān)。因此人們在提高微生物的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶量時(shí)，必須對發(fā)酵條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控，以確定該菌最適的產(chǎn)酶條件，為更強(qiáng)抑制真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，激發(fā)植物啟動防御反應(yīng)，使植物產(chǎn)生更多的防御蛋白，增強(qiáng)植物的抗性提供基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，，特異性高，工藝簡單，蛋白質(zhì)不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，包括如下步驟:
(1)粗酶液的制備；
(2)離子交換層析；
(3)凝膠過濾。
[0006]進(jìn)一步的:所述粗酶液的制備:用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈霉菌，在幾丁質(zhì)酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液離心，上清液用真空抽濾，除去雜質(zhì)收集濾液，向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置過夜，再次離心收集沉淀，用緩沖液溶解沉淀，離心溶解液除去不溶物體，上清液裝于透析袋，經(jīng)pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液；
進(jìn)一步的:所述培養(yǎng)基為:2% (w/V)的膠體幾丁質(zhì)100ml/L，黃豆餅粉0.4wt%,K2HPO4L 0 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
[0007]進(jìn)一步的:所述離心條件為4°C,轉(zhuǎn)速8500~12000 rpm,時(shí)間10~15 min。
[0008]進(jìn)一步的:所述離子交換層析:粗酶液經(jīng)過聚乙二醇PEG20000濃縮后，用0.01-0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡過夜，上樣于充分平衡后的DEAE A-52陰離子交換層析柱，用0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線開始走平后，改用含0~lmol/L NaCl的
0.01~0.03mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行連續(xù)洗脫，收集洗脫液。[0009]進(jìn)一步的:所所述洗脫條件為:流速35mL/h ；5mL/管。
[0010]進(jìn)一步的:所述凝膠過濾:用pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液充分平衡的S^hadex G-75凝膠過濾層析柱，上樣后，再用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集有酶活性的部份。
[0011]進(jìn)一步的:所述洗脫條件為:流速15-25 mL/h，5mL/管。
[0012]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明方法特異性高，工藝簡單，蛋白質(zhì)不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0014]實(shí)施實(shí)例一
(I)用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基(2% (w/V)的膠體幾丁質(zhì)100ml/L、黃豆餅粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培養(yǎng)菌株，在幾丁質(zhì)酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液，8500rpm離心lOmin，上清液用真空抽濾，收集濾液。向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置過夜。12000 rpm、4°C離心15 min收集沉淀，用適量0.01mol/L的緩沖液溶解沉淀。12000 rpm、4°C離心15 min除去不溶物體，上清液裝于透析袋，經(jīng)0.01 mo I/L的磷酸鹽緩沖液(PH6.5)透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液。
[0015](2)將上述粗酶液經(jīng)過0.01 mo I/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000適當(dāng)濃縮后,上樣到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow陰離子交換層析柱。以平衡膠柱用的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，再以含0.1 mol/LNaCl的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行鹽離子梯度連續(xù)洗脫，共洗脫出2個(gè)蛋白質(zhì)峰。測定收集液的幾丁質(zhì)酶活性發(fā)現(xiàn)，上述收集液中后一個(gè)峰的酶活最高，酶活達(dá)到4.36U/ml，主要集中在400min時(shí)間收集的管中。
[0016](3)用PEG20000適當(dāng)濃縮400min獲得的收集液，上樣到充分平衡好的S印hadexG-75凝膠過濾柱。以平衡膠柱用的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，共洗脫出三個(gè)蛋白峰，對每個(gè)峰分別測酶活得出第一個(gè)峰的酶活最高為5.64 U/ml，其他峰的酶活很小接近于零，所以這個(gè)峰的取出液就是我們要的幾丁質(zhì)酶。
[0017](4)上述活性峰用SDS-PAGE電泳，表現(xiàn)為單帶，表明純化后的幾丁質(zhì)酶為單一組分，已達(dá)到電泳純。
[0018]實(shí)施實(shí)例二
(I)用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基(2% (w/V)的膠體幾丁質(zhì)100ml/L、黃豆餅粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培養(yǎng)菌株，在幾丁質(zhì)酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液，8500rpm離心lOmin，上清液用真空抽濾，收集濾液。向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置過夜。12000 rpm、4°C離心15 min收集沉淀，用適量的緩沖液溶解沉淀。12000 rpm、4°C離心15 min除去不溶物體,上清液裝于透析袋,經(jīng)0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇濃縮得 到粗酶液。[0019](2)將上述粗酶液經(jīng)過0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000適當(dāng)濃縮后，上樣到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow陰離子交換層析柱。以平衡膠柱用的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，再以含0.5mol/L NaCl的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行鹽離子梯度連續(xù)洗脫，共洗脫出2個(gè)蛋白質(zhì)峰。測定收集液的幾丁質(zhì)酶活性發(fā)現(xiàn)，上述收集液中后一個(gè)峰的酶活最高，酶活達(dá)到4.36U/mL，主要集中在450 min時(shí)間收集的管中。
[0020](3)用PEG20000適當(dāng)濃縮450 min獲得的收集液，上樣到充分平衡好的S印hadexG-75凝膠過濾柱。以平衡膠柱用的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，共洗脫出三個(gè)蛋白峰，對每個(gè)峰分別測酶活得出第一個(gè)峰的酶活最高為5.64 U/mL，其他峰的酶活很小接近于零，所以這個(gè)峰的取出液就是我們要的幾丁質(zhì)酶。
[0021](4)上述活性峰用SDS-PAGE電泳，表現(xiàn)為單帶，表明純化后的幾丁質(zhì)酶為單一組分，已達(dá)到電泳純。
[0022]實(shí)施實(shí)例三
(I)用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基(2% (w/V)的膠體幾丁質(zhì)100ml/L、黃豆餅粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培養(yǎng)菌株，在幾丁質(zhì)酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液，8500rpm離心lOmin，上清液用真空抽濾，收集濾液。向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置過夜。12000 rpm、4°C離心15 min收集沉淀，用適量的緩沖液溶解沉淀。12000 rpm、4°C離心15 min除去不溶物體,上清液裝于透析袋,經(jīng)0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液。
[0023](2)將上述粗酶液經(jīng)過0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000適當(dāng)濃縮后，上樣到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow陰離子交換層析柱。以平衡膠柱用的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6.5)進(jìn)行洗脫，再以含I mol/L NaCl的0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行鹽離子梯度連續(xù)洗脫，共洗脫出2個(gè)蛋白質(zhì)峰。測定收集液的幾丁質(zhì)酶活性發(fā)現(xiàn)，上述收`集液中后一個(gè)峰的酶活最高，酶活達(dá)到4.36 U/mL，主要集中在500 min時(shí)間收集的管中。
[0024](3)用PEG20000適當(dāng)濃縮500 min獲得的收集液，上樣到充分平衡好的S印hadexG-75凝膠過濾柱。以平衡膠柱用的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，共洗脫出三個(gè)蛋白峰，對每個(gè)峰分別測酶活得出第一個(gè)峰的酶活最高為5.64 U/mL，其他峰的酶活很小接近于零，所以這個(gè)峰的取出液就是我們要的幾丁質(zhì)酶。
[0025](4)上述活性峰用SDS-PAGE電泳，表現(xiàn)為單帶，表明純化后的幾丁質(zhì)酶為單一組分，已達(dá)到電泳純。
[0026]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)粗酶液的制備； (2)離子交換層析； (3)凝膠過濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述粗酶液的制備:用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈霉菌，在幾丁質(zhì)酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液離心，上清液用真空抽濾，除去雜質(zhì)收集濾液，向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置過夜，再次離心收集沉淀，用緩沖液溶解沉淀，離心溶解液除去不溶物體，上清液裝于透析袋，經(jīng)pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液透析后，再用聚乙二醇濃縮得到粗酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基為:2% (w/V)的膠體幾丁質(zhì) 100ml/L,黃豆餅粉 0.4wt%，K2HPO4L 0 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述離心條件為 4°C，轉(zhuǎn)速 8500 ~12000 rpm,時(shí)間 10 ~15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述離子交換層析:粗酶液經(jīng)過聚乙二醇PEG20000濃縮后，用0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡過夜，上樣于充分平衡后的DEAE A-52陰離子交換層析柱，用0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線開始走平后，改用含0-lmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行連續(xù)洗脫，收集洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所所述洗脫條件為:流速35mL/h ；5mL/管。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述鏈霉菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述凝膠過濾:用pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液充分平衡的Sephadex G-75凝膠過濾層析柱，上樣后，再用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集有酶活性的部份。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的扁座殼孢菌幾丁質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在于:所述洗脫條件為:流速15-25 mL/h，5mL/管。
【文檔編號】C12N9/42GK103667218SQ201310650637
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】段升華 申請人:中山奈德生物科技有限公司