一種從鈣化組織中提取rna的方法

一種從鈣化組織中提取rna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從鈣化組織中提取RNA的方法。其方法步驟為：將鈣化組織在液氮中進行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時,加入Trizol，再加液氮繼續研磨成粉末狀，直至直徑約1mm或小于1mm為止；再將所得粉末轉移到RNase-Free的小管中，加入Trizol消化裂解細胞；將上述小管離心后將上清轉移到新的小管；上清加入氯仿處理后離心，將最上層的水相轉移到另一新的小管，加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；然后轉移到試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結合到吸附柱上；用試劑盒溶液洗滌；再進行洗脫即得到鈣化組織總RNA。得到的鈣化組織總RNA的收率高，純度高、質量、完整性好。
【專利說明】一種從鈣化組織中提取RNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及海洋生物技術，尤其涉及一種從鈣化組織中提取RNA的方法，特別是從造礁珊瑚中提取核糖核酸RNA的方法。
【背景技術】
[0002]鈣化組織是指鈣鹽在軟組織中沉積，并使其硬化的過程。提取鈣化組織中鈣化細胞中總RNA通常是對鈣化組織轉錄組測序、表達譜測序、cDNA克隆、RT-PCR和Northernblot等分子生物學實驗研究的第一步，總RNA的質和量決定著后續實驗的成敗和質量。目前，提取培養的骨細胞系以及各種臟器中總RNA方法的報道有很多，但從鈣化組織中提取總RNA的方法一直處于摸索間段。傳統的提取方法所得到的RNA純度以及產量較低，難以進行后續實驗。為獲得較完整、純度高、產量高的鈣化組織RNA，本專利人在實踐中摸索出有效的提取造礁珊瑚等鈣化組織中核糖核酸RNA的方法。
[0003]目前，一般鑒定RNA的純度和RNA質量的方法為
1)用檢測RNA溶液的吸光度來鑒定RNA的純度
230nm、260nm、280nm下的吸光度分別代表了鹽濃度、核酸和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看0D260/0D280。當0D260/0D280的比值為1.8-2.0時，認為RNA中蛋白或者是其他有機物的污染很少。當0D260/0D280〈1.8時，溶液中蛋白或者是其他有機物的污染比較明顯，可根據實驗需要決定這份RNA的命運。當0D260/0D280>2.2時，說明RNA已經水解成單核苷酸了。A260/A230的比值表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有1^1七&-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA ；
2)用RNA的電泳圖譜鑒定RNA的質量
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認為RNA的質量是好的；
這兩種方法都無法明確的知道RNA溶液中有沒有RNA酶殘留。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法很難察覺，但是大部分后續的酶學反應都是在37°C以上并且是長時間進行的。如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，后續的實驗中RNA酶就會有非常適合的環境和時間發揮它們的作用，而導致實驗的失敗。故需要進一步確證； 3)用保溫試驗進一步確定RNA溶液有無RNA酶的殘留
從RNA溶液中吸取兩份約1000 ng的RNA加入0.5 ml的離心管中，用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70°C的恒溫水浴中，保溫I h。另一份放置在_20°C冰箱中保存I h。隨后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，t匕較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別(當然，它們的條帶也要符合上述
2)中的方法條件)，則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70°C保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種快速，有效地從造礁珊瑚等鈣化組織中提取到完整核糖核酸RNA的方法。
[0005]為實現上述目的，本發明提供一種從鈣化組織中提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟，
液氮研磨鈣化組織:將鈣化組織在液氮中進行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時，加入Trizol,再加液氮繼續研磨成粉末狀,直至直徑約1_或小于Imm為止；
充分裂解:將所得粉末轉移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入Trizol試劑，溫和混勻，室溫靜置，期間顛倒混勻一次，消化裂解細胞；
提取:將上述小管在4°C離心，將上清轉移到新的小管；上清加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后離心，離心后的樣品分為三層，將最上層的水相轉移到另一新的小管，加A 75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；
吸附:將上步所得轉移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結合到吸附柱上；
洗漆:用RNA Wash Buffer I洗漆吸附柱一次，再用RNA Wash Buffer II洗漆吸附柱一次，室溫放置IOmins ；
洗脫:用RNase-Free的水100_200ul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA。
[0006]所述液氮研磨鈣化組織中Trizol的加入量為25_50mg 鈣化組織/ml Trizol來加入。
[0007]所述充分裂解中Trizol的加入量為25_50mg 鈣化組織/ml Trizol來加入； 任選的，所述室溫靜止10分鐘，期間2分鐘顛倒混勻一次；
所述提取為充分裂解后的小管在4°C, 1000Orpm離心2mins,將上清轉移到新的小管；上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入200ul的氯仿,顛倒混勻30s,室溫靜置15min后高速離心，使不溶物沉于管底；離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉移到另一新的小管，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸優選的；
所述高速離心條件為:4°C, 1000Orpm離心lOmins。
[0008]所述鈣化組織是造礁珊瑚，紅柳珊瑚；鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。
[0009]采用本發明方法提取的鈣化組織總RNA的收率高，并且純度高、質量、完整性好，可以滿足分子生物學研究應用。
[0010]一般認為鈣化組織所含的活細胞數相對交少，細胞中的RNA含量也較少，而本發明方法中，采取了充分、分步研磨，使其中的RNA成分能充分提取出來，同時與試劑盒相結合，得到完整性好、純度高的RNA。
[0011]本發明的制備方法具有如下優點:提取RNA的方法快速、簡便、整個實驗過程僅需2-3小時即可完成；通過用五洲東方的BD-2000型超微量紫外分光光度計(型號:BD-2000，廠商:五洲東方)測定RNA的濃度和安捷倫2100生物分析儀(型號:agilent G2939A，廠商:安捷倫)對RNA純度和完整性檢測表明，所提取的RNA純度高、質量、完整性好，為轉錄組測序和使用RT-PCR檢測法提供理想、合格的RNA樣品。同時經過多次的對比實驗和檢測試驗，結果表明:用本法提取鈣化組織中的RNA不含有破壞RNA和抑制逆轉錄及PCR反應的因子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是所提取的RNA的電泳圖；
圖2是所提取的RNA進行保溫試驗后的電泳圖；
圖3是鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結果圖；
圖4是紅柳珊瑚RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結果圖；
圖5是鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0013]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0014]實施例1: RNA的提取
(O液氮研磨組織:用鐵錘等硬物從珊瑚礁上敲下一塊鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)和紅柳珊瑚組織；用DEPC·水處理并滅菌后的剪刀分別剪下鯽魚魚鱗表面的硬鱗層，放于液氮預冷的研缽中，加入少量液氮敲碎迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，研磨到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時將樣品轉移到2mlEP管中，先加入500ulTrizol,(整個實驗按 50-100mgRNA/ml Trizol 需要加入 Iml Trizol,(參見 Trizol 使用說明書，廠商:上海閃晶分子生物技術研究所)。Trizol先用一半的量，另一半的量在(2)中補齊，因為研磨時間長，加Trizol防止RNA降解)，再加液氮繼續研磨成粉末狀，直至直徑約Imm或小于Imm為止；
(2)充分裂解:將(I)所得粉末轉移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入500ulTrizol試劑,補足(I)中所述一半的量,溫和混勻，室溫靜置10 mins,期間2分鐘顛倒混勻一次，消化裂解細胞，使得核糖核酸(RNA)更容易從細胞中釋放出來；
(3)提取:將(2)步的小管在4°C，1000Orpm離心2mins，將上清轉移到新的小管(去除礁石粉末)。上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入200ul的氯仿,顛倒混勻30s,室溫靜置15min (氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離，氯仿本身也對蛋白有變性作用，然后析出變性蛋白)，高速離心，使不溶物沉于管底。高速離心條件為:4°C，1000Orpm離心IOmins，離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉移到另一新的小管，切忌吸到其它相(蛋白)，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；
(4)吸附:將上步所得轉移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購來源:OMEGA ;貨號:R6934-01)試劑盒的吸附柱上，靜置5mins，5000rpm離心30mins，RNA結合到吸附柱上；
(5)洗滌:用 E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購來源:0MEGA ;貨號:R6934-01)試劑盒中的 RNA Wash Buffer I 洗滌吸附柱一次，用 Ε.Ζ.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購來源=OMEGA ;貨號:R6934-01)試劑盒中的RNA Wash Buffer II洗滌吸附柱一次，室溫放置lOmins。通過使用RNA Wash Buffer I和RNA Wash Buffer II兩次洗漆去除蛋白復合物，使吸附柱上的核糖核酸(RNA)更純凈。
[0015](6)洗脫:用RNase-Free的水IOOul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA，_80°C保存備用;
(7)檢測RNA溶液的濃度和吸光度:
通過用五洲東方的BD-2000型超微量紫外分光光度計(型號:BD-2000，廠商:五洲東方)測定RNA的濃度和吸光度，濃度為:鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種):80ng/ul，有lOOul。紅柳珊瑚組織:160ng/ul，有lOOul，鯽魚魚鱗表面的硬鱗層:119ng/ul，有100ul。檢測RNA溶液的吸光度為:鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種):0D260/0D280=1.98, A260/A230=2.1。紅柳珊瑚組織:0D260/0D280=1.97，A260/A230=2.2，鯽魚魚鱗表面的硬鱗層:0D260/0D280=2.0, A260/A230=2.2。此結果滿足當 0D260/0D280 的比值為 1.8-2.0 時，RNA 中蛋白或者其他有機物的污染很少，不影響后續實驗或者影響很小，可以忽略不計。A260/A230的比值表明RNA的純度，其值介于2.0和2.4之間，表明裂解液中沒有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，無需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。[0016](8)電泳檢測:用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，其中泳道Marker為DL2000;泳道I為鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)；泳道2為紅柳珊瑚；泳道3為鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。從圖1可以看出，有28S和18S的帶，就說明提取成功，28S和帶比18S的帶亮2倍，并且后面沒有拖帶，說明沒被降解，完整性好。28S和18S大概在DL2000marker的2000bp以下；真核生物的核糖體rRNA，在小亞單位中的為18 srna核苷酸單鏈:1900nt，即1900個堿基，950個堿基對，等于950bp ;在大亞單位中的為28srna核苷酸單鏈:4700nt，即4700個堿基，等于2350個堿基對，多拷貝4700/3=1566bp。一般28srna和18 srna電泳圖參見文獻:《一種簡單有效的植物RNA提取方法_張容.pdf.》。
[0017](9)保溫試驗，保溫試驗后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖譜見圖2。
[0018]從三份RNA溶液中各吸取兩份約1000 ng的RNA加入0.5 ml的離心管中，用ρΗ7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70°C的恒溫水浴中，保溫I h。另一份放置在_20°C冰箱中保存I h。隨后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶，結果見圖2。圖2中的1、2、3泳道分別代表鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)、紅柳珊瑚組織、鯽魚魚鱗表面的硬鱗層在70°C的恒溫水浴中，保溫I h后的泡膠結果；圖2中的4、5、6泳道分別代表鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)、紅柳珊瑚組織、鯽魚魚鱗表面的硬鱗層在-20°C冰箱中保存I h后的跑膠結果。可以看出，上述兩種條件處理后RNA跑膠的條帶一致，無明顯差別，28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。
[0019]實施例2
用安捷倫2100生物分析儀(型號:agilent G2939A，廠商:安捷倫)測定RNA濃度和完整性，本儀器說明書中指出RNA完整性數值(RIN)大于I和28s/18s在1_3之間為RNA完整性較好；用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量Iul，模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認為RNA的質量是好的。
[0020]圖3為鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號:agilentG2939A，廠商:安捷倫)檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結果，從圖中可以看出RNA完整性數值(RIN)等于8.1，符合完整性數值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于1.2，符合28s/18s在1-3之間的要求，所以本實驗認為本次提取的鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA完整性好；用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認為本次提取的鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的質量是好的。
[0021]圖4為紅柳珊瑚RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號:agilent G2939A，廠商:安捷倫)檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結果，從圖中可以看出RNA完整性數值(RIN)等于7.3，符合完整性數值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于2.0，符合28s/18s在1_3之間的要求，所以本實驗認為本次提取的紅柳珊瑚RNA完整性好。用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認為本次提取的紅柳珊瑚的RNA的質量是好的。
[0022]圖5為鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號:agilentG2939A，廠商:安捷倫)檢測結果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結果，從圖中可以看出RNA完整性數值(RIN)等于8.5，符合完整性數值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于2.8，符合28s/18s在1_3之間的要求，所以本實驗認為本次提取的鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA完整性好。用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號:5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認為本次提取的鯽魚魚鱗表面的硬鱗層的RNA的質量是好的。
[0023]盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權利要求】
1.一種從鈣化組織中提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟， 液氮研磨鈣化組織:將鈣化組織在液氮中進行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時，加入Trizol,再加液氮繼續研磨成粉末狀,直至直徑約Imm或小于Imm為止； 充分裂解:將所得粉末轉移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入Trizol試劑，溫和混勻，室溫靜置，期間顛倒混勻一次，消化裂解細胞； 提取:將小管在4°C離心，將上清轉移到新的小管；上清加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后離心，離心后的樣品分為三層，將最上層的水相轉移到另一新的小管，加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸； 吸附:將上步所得轉移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結合到吸附柱上； 洗漆:用RNA Wash Buffer I洗漆吸附柱一次，再用RNA Wash Buffer II洗漆吸附柱一次，室溫放置IOmins ； 洗脫:用RNase-Free的水100_200ul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA。
2.權利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述液氮研磨鈣化組織中Trizol的加入量為25-50mg鈣化組織/ml Trizol來加入。
3.權利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述充分裂解中Trizol的加入量為25-50mg鈣化組織/ml Trizol來加入； 任選的，所述室溫靜止10分鐘，期間2分鐘顛倒混勻一次。
4.權利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述提取為充分裂解后的小管在4°C, 1000Orpm離心2mins,將上清轉移到新的小管；上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后高速離心，使不溶物沉于管底；離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉移到另一新的小管，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸優選的； 所述高速離心條件為:4°C, 1000Orpm離心lOmins。
5.權利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述鈣化組織是造礁珊瑚，紅柳珊瑚；鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。
【文檔編號】C12N15/10GK103667258SQ201310648321
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】陳建明, 暨國彪, 郭輝革, 楊慧 申請人:國家海洋局第三海洋研究所