表面展示花生過敏原的重組乳酸乳球菌的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述了表面展示花生過敏原Arah2的重組乳酸乳球菌的構建方法及其應用。本發(fā)明對花生過敏原Arah2的天然基因序列進行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化基因nArah2，構建了針對nArah2的細胞壁錨定表達方式的重組載體和乳酸乳球菌工程菌。本發(fā)明涉及的重組菌株作為口服疫苗免疫小鼠，可有效調節(jié)小鼠過敏性的免疫反應。因此，本發(fā)明可被開發(fā)為粘膜疫苗用于花生過敏的預防和治療。
【專利說明】表面展示花生過敏原的重組乳酸乳球菌的制備方法及其應用
【【技術領域】】
[0001]本發(fā)明涉及表面展示表達花生過敏原Arah2的重組乳酸乳球菌菌株，其構建方法及應用，屬于生物工程【技術領域】。
【【背景技術】】
[0002]花生過敏是最嚴重而且常見的食物過敏反應之一，具有發(fā)病快、致死率高及
[0003]終生性等特點。近些年來，花生過敏的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有逐年上升的趨勢。在美國，有1.1%的人口對花生過敏，其發(fā)病率在1997年至2002年間增長了近一倍。誘導特異性口服耐受，即在一段時間內(nèi)通過給予患者逐漸增加劑量的過敏原以誘導患者對此種食物抗原產(chǎn)生免疫耐受的治療方法，是目前比較有效的花生過敏治療方法。
[0004]高純度過敏原的獲取是進行免疫耐受性誘導的前提和基礎?；ㄉ^敏原共有11種，其中Arah2是一種分子量為17_19KDa的糖蛋白，可被超過90%的患者血清中IgE特異性識別，是目前研究最廣泛也是最重要的花生過敏原之一。近些年來，分子生物學技術的發(fā)展使利用生物合成方法獲取高純度的過敏原成為可能。目前已有國內(nèi)外研究者利用不同表達系統(tǒng)生產(chǎn)花生過敏原，如陶愛林等(2012)在專利《一種重組花生過敏原與突變體及其制備方法和應用》中介紹了利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備一種重組花生過敏原與突變體的方法；KatrinLehmann等已成功利用大腸桿菌重組表達具有良好免疫原性的Arah2蛋白(KatrinLehmann, etal.High-yieldexpressioninEscherichiacoli, purification, andcharacterizationofproperIyfoldedmajorpeanutalIergenArah2.ProteinExpressionandPurification, 2003, 3 1:250 - 259)。但大腸桿菌可產(chǎn)生結構復雜、種類繁多的內(nèi)毒素，且表達產(chǎn)物的后續(xù)純化成本高昂，限制了大腸桿菌原核表達系統(tǒng)的臨床應用。
[0005]乳酸乳球菌長期以來被廣泛應用于酸奶、奶酪、泡菜等傳統(tǒng)食品的生產(chǎn)中，是公認安全的微生物。利用乳酸乳球菌表達外源蛋白可無需純化連同菌體一起服用，同時利用乳酸乳球菌作為表達載體的黏膜疫苗可有效誘導機體產(chǎn)生免疫反應和免疫耐受。已有研究表明，利用宿主細胞表面展示技術表達外源抗原或治療性蛋白，所制備的乳酸乳球菌粘膜疫苗可有效激發(fā)機體保護性的免疫反應。Xin等研究者將HIV病毒包膜蛋白的V2-V4區(qū)片段錨定在乳酸乳球菌細胞表面進行展示表達，用此重組菌口服免疫小鼠可刺激機體產(chǎn)生高水平抗HIV的特異性血清IgG和糞便IgA抗體，使小鼠卵巢中HIV病毒載量降低350倍(Xin, etal.1mmunogenicityandprotectiveefficacyoforallyadministeredrecombinantLactococcusIactisexpressingsurface-boundHIVEnv.Blood, 2003, 102:223-228)。因此，我們利用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作為粘膜疫苗呈遞載體,將花生過敏原Arah2在L.1actis細胞表面進行展示表達，所構建的重組乳酸乳球菌在醫(yī)藥工業(yè)等領域具有廣闊的應用前景。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種表面展示表達花生過敏原蛋白nArah2的重組乳酸乳球菌菌株及其構建方法，該菌株是用含有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼花生過敏原蛋白nArah2的編碼基因的重組質粒pNZ3轉化乳酸乳球菌所獲得的，其中所使用的乳酸乳球菌可以是L.lactisNZ9000。轉化后篩選所獲得的菌株為L.lactisNZCW，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏編號為CGMCCN0.8218。本發(fā)明還涉及所述重組乳酸乳球菌菌株的構建方法，所述方法包括如下步驟:a)對花生過敏原Arah2的天然基因序列進行密碼子優(yōu)化以得到優(yōu)化基因nArah2 ；b)利用優(yōu)化基因nArah2進一步構建重組表達質粒；c)利用重組表達質粒轉化乳酸乳球菌并篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株，其中所構建的重組表達質粒是錨定表達載體質粒PNZ3，構建重組表達質粒PNZ3時包括以L.lactissubsp.cremorisMG1363的基因組DNA為模板，利用引物 PcalF:5’ -TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’ -CCGCAAGCTTTTAITTTAITCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR 擴增-cwa 序列；利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral， R:5’-CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3’PCR 擴增-SPusp45-nArah2融合序列的步驟,步驟c)中的轉化方法是電轉化。
[0007]本發(fā)明還涉及包含所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制劑，例如膠囊劑、錠劑、粉劑或顆粒劑等。
[0008]本發(fā)明還涉及所述的重組質粒或重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
[0009]本發(fā)明中重組花生過敏原蛋白nArah2成功地錨定在L.lactisNZ9000細胞表面進行展示表達，且動物實驗結果表明，表面展示表達方式的重組乳酸乳球菌疫苗可調節(jié)過敏性的系統(tǒng)免疫反應，逆轉Th2型免疫應答向Thl型免疫應答轉變。
[0010]因此，優(yōu)化的花生過敏原nArah2基因可以重組質粒DNA疫苗的形式用于花生過敏的預防及治療；重組乳酸乳球菌菌株可以膠囊、錠劑、粉包、顆粒狀包裝的形式，作為一種新型的口服疫苗應用于花生過敏的臨床預防及免疫治療。
[0011]本發(fā)明涉及的重組乳酸乳球菌LactococcuslactisNZCW, 2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.8218 ；
[0012]乳酸乳球菌Lactococcus IactisNZNH, 2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.8216。
【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0013]圖1乳酸乳球菌重組質粒PNZ3的結構示意圖；
[0014]圖2:重組菌株L.1actisNZCff中蛋白表達情況的Westernblot檢測圖:泳道I為純化的nArah2蛋白作為陽性對照，泳道2、3分別為L.lactisNZ48菌株的培養(yǎng)物上清和細胞沉淀組分，泳道4-6分別為L.1actisNZCff菌株培養(yǎng)物的原生質體、細胞壁和上清組分；
[0015]圖3:動物實驗免疫程序圖；
[0016]圖4:激發(fā)后血清中特異性抗體水平:A-C分別為特異性的IgE、IgG2a、IgGl水平，*表示實驗組與Sham組之間差異性顯著，P〈0.05?！尽揪唧w實施方式】】
[0017]以下通過實施例來進一步闡述本發(fā)明，下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊進行實驗操作，各種試劑如無特殊說明，其濃度均為質量百分比濃度。
[0018]實施例1 Arah2基因序列的密碼子優(yōu)化
[0019]首先利用信號肽預測軟件SignalP4.1Server對Arah2的氨基酸序列(genbank:AAN77576.1)的信號肽序列進行了預測，在與上述氨基酸序列相對應的基因序列(genbank:AY158467.1)中去除預測得到的信號肽序列，得到待優(yōu)化的原始核苷酸序列。
[0020]根據(jù)乳酸乳球菌偏愛密碼子表對原始核苷酸序列進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因命名為nArah2,由生工生物工程(上海)有限公司進行全基因合成，并亞克隆至載體pUC57上，得到PUC57-nArah2 (由上海生工合成，其中pUC57為商業(yè)化質粒)。[0021]優(yōu)化前天然基因序列(genbank:AY158467.1), SEQIDN0.1。
[0022]優(yōu)化后基因序列(nArah2)，SEQIDN0.2。
[0023]優(yōu)化前氛基酸序列(genbank:AAN77576.1), SEQIDN0.3?
[0024]優(yōu)化后氨基酸序列，SEQIdN0.4。
[0025]實施例2重組表達載體pNZ3的構建
[0026]利用 L.lactissubsp.cremorisMG1363 (Gasson.PlasmidcomplementsofStreptococcus lactis NCD0712and other lactic streptococci after protoplast-1nducedcuring.Journal of Bacteriology.1983，154 (I): 1-9)中固有 N-乙酸胞壁質酶 AcmA 基因(為Genebank已公開基因序列，GenBank:U17696.1)中的cA結構域作為錨定功能序列CffA0利用L.lactis subsp.cremorisMG1363的基因組DNA為模板，利用引物PcalF:5’-TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’-CCGCAAGCTTTTATTTTATTCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR擴增進行PCR擴增-cwa序列。PCR反應體系(總體積為50 u L)為:10XKODplusbuffer:5u L ；dNTP:5u L ；MgS04:2u L ;DNA 模板:2u L ;上游引物 / 下游引物(20iiM):各 Iii L ；K0Dplus:0.5u L ；ddH20:33.5u L0 反應程序:95°C 30s (變性)，59°C 30s (退火)，68°C 60s (延伸)，擴增 30 次循環(huán)。同時以質粒 pNZ8148_SPUsp45_nArah2作為模板，利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral’ R:5’ -CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3’ PCR 擴增進行 PCR 擴增 _SPUsp45_nArah2 融合序列。PCR 反應體系同上。反應程序:95°C 30s (變性)，60°C 30s (退火)，68°C 50s (延伸)，擴增30次循環(huán)。將回收純化的兩片段-cwa、-SPUsp45-nArah2及載體pNZ8148分別酶切反應后進行連接反應，得到質粒pNZ8148-SPUsp45-nArah2-cwa，命名為pNZ3，質粒組成參見圖1。
[0027]實施例3重組乳酸乳球菌的制備
[0028]將上述構建質粒pNZ3 電擊轉化 L.lactisNZ9000 (Kuipersetal.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.Journal ofBiotechnology.1998，64(I): 15-21)感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行菌落PCR和雙酶切驗證并送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序驗證，將測序正確的轉化子命名為L.lactisNZCW，將攜帶空質粒菌株 L.lactisNZ9000/pNZ8148 命名為 L.lactisNZ48。
[0029]實施例4 Western blot分析重組蛋白的表達情況[0030](I)重組L.lactisNZ9000菌株的誘導表達:
[0031]挑取驗證正確的重組菌株的單菌落接入含10 u g/ml氯霉素(Cm) GMl7培
[0032]養(yǎng)基(每升GM17培養(yǎng)基配方:大豆蛋白胨5g，細菌蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉
2.5g，葡萄糖5g，(6-磷酸甘油二鈉19g，維生素C0.5g, lmol/LMgS041mL)中，30°C靜置培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液以2%接種量轉接入GM17 (CmlOu g/ml)液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入nisin (Sigma，購自上海悠揚生物科技有限公司)作為誘導物，使其終濃度為50ng/ml，3 0°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時。
[0033](2)蛋白樣品制備:
[0034]誘導結束后將菌液于4°C,5, OOOg離心IOmin,所得上清液中加入100% (w/v)三氯乙酸(TCA)至終濃度為16% (w/v)，冰上放置至少30min，4°C，12，000Xg離心30min，收集沉淀用預冷的丙酮洗滌兩次，最后將沉淀溶解于50mMNa0H溶液中，-80°C保存以待檢測。菌體沉淀用 TES (IOmMTris-HCl [pH8.0]，ImMEDTA, 25%sucrose)溶液洗滌兩次后，重懸于 TES(10mg/mL溶菌酶，0.lmg/mLRNase)中，37°C溫浴Ih0將得到上述菌液4°C，2500X g離心IOmin后所得上清的處理方法同培養(yǎng)物上清液，所得樣品用于分析細胞壁中蛋白分布情況；離心所得沉淀重懸于TES后用于分析原生質體中蛋白分布情況。所得樣品均保存于_80°C以待檢測；
[0035](3) Western blot分析重組蛋白表達情況:
[0036]上述制備的蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離后，150mA恒流轉膜50min
[0037]將蛋白轉移至PVDF膜(Millipore，購自中科瑞泰生物科技有限公司)上；轉印膜經(jīng)TBST (每升10XTBS緩沖液配方:Tris2.42g，NaC18g，用HCl調PH至7.6 ；TBST緩沖液配方:10 X TBSlOOml，蒸餾水900ml, Tween-200.1%)洗滌后，用TBST (含5%脫脂奶粉)室溫封閉1.5h ;然后轉印膜與一抗(1:750稀釋度)于4°C過夜孵育；用HRP標記羊抗兔二抗(1: 1.2 X IO4稀釋度，購自上海悠揚生物科技有限公司)和轉印膜室溫條件下雜交Ih后，向轉印膜上滴加顯色液(購自北京康為世紀生物科技有限公司)后避光條件下顯色。檢測結果參見圖2。如圖所示:陰性對照菌株的上清及沉淀部分(泳道2和3)中未檢測出信號，在陽性對照(泳道I)檢測出約19kDa片段(與nArah2蛋白的預期大小一致);在菌株L.lactisNZCW的細胞壁部分(泳道5)檢測出約46kDa片段，推測可能為去掉信號肽的nArah2-CWA蛋白；L.lactisNZCW的原生質體部分(泳道4)檢測出約49kDa片段，可能為SPUsp45-nArah2_CWA前體蛋白。
[0038]實施例5動物模型評價疫苗免疫效果
[0039]疫苗制備過程如下:重組菌株的誘導表達步驟如上所述。將誘導結束后的菌液4°C，5，000g離心lOmin，所得菌體沉淀用無菌PBS洗滌兩次后重懸于PBS中，使其濃度為I X 101(lCFU/ml，所得新鮮菌懸液用于免疫動物。
[0040]動物實驗流程如圖3所示:50只3-5周齡雌性C3H/HeJ小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司)適應性喂養(yǎng)一周后隨機分成5組(10只/組)，動物實驗分三個階段:(I)預防階段:第-14-0連續(xù)兩周每天灌胃2X IO9CFU新鮮制備的重組菌株；(2)致敏階段:第0、1、2、7、14、21天灌胃12mg花生蛋白粗提物(CPE)和10 y gCT ; (3)激發(fā)階段:第28天灌胃30mgCPE進行激發(fā)。
[0041]設第I組為天然組(Naive group)，在整個實驗過程中正常喂養(yǎng)。第2組為模型組(Sham group)，在預防階段灌胃PBS，而在致敏階段進行正常的致敏。第3_5組(分別命名為Vector組、CYT組和CWA組)為實驗組，在預防階段分別灌胃重組菌株L.lactis NZ48、L.lactis NZNH (已構建的可胞內(nèi)表達nArah2的重組乳酸乳球菌菌株；在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8216)和L.lactis NZCW，在致敏階段均灌胃CPE和CT進行致敏。所有組別的小鼠均在第28天灌胃CPE進行激發(fā)。
[0042]第35天激發(fā)后30_40min收集小鼠血清樣品，_80°C保存用于后續(xù)檢測血清中過敏原特異性抗體水平；實驗結束后處死小鼠并無菌分離小鼠脾臟制備脾細胞懸液，加入50 u g/mL花生粗提物(CPE)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72h，收集上清保存于_80°C用于檢測細胞因子水平。
[0043]實驗結果表明:灌胃L.lactis NZNH和L.lactis NZCW均可抑制激發(fā)后小鼠血清中特異性IgE和促進特異性IgG2a的產(chǎn)生，但僅L.lactis NZCW組的變化達到統(tǒng)計學的顯著性水平(P〈0.05);說明在調節(jié)系統(tǒng)性的體液免疫反應方面，L.lactis NZCff的調節(jié)作用優(yōu)于L.lactis NZNH(參見圖4)。與Sham組相比，CWA組和CYT組脾細胞中Th2型細胞因子IL-4的數(shù)量和Thl型細胞因子IFN- y的數(shù)量、Thl/Th2細胞因子比例分別有降低和升高的趨勢，而CWA組的變化程度明顯大于CYT組；這說明在調節(jié)細胞免疫反應方面L.lactisNZCW的調節(jié)作用更優(yōu)越(參見表1)?；谝陨辖Y果，在體液免疫和細胞免疫方面，表面展示型重組乳酸乳球菌作為黏膜疫苗均可有效逆轉過敏性的Th2型免疫應答向保護性的Thl型免疫應答方向轉變，對花生過敏具有有效的免疫調節(jié)作用。
[0044]表1:脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子水平
【權利要求】
1.一種能表面展示花生過敏原nArah2的重組乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株為LactococcuslactisNZCW, 2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCCN0.8218。
2.包含權利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述疫苗為口服制劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的包含重組乳酸乳球菌菌株的疫苗，其特征在于，所述口服制劑為膠囊劑、錠劑、粉劑、錠劑或顆粒劑。
4.權利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株在制備可用于治療花生過敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。
5.一種制備權利要求1所述的重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: a)對花生過敏原Arah2的天然基因序列進行密碼子優(yōu)化以得到優(yōu)化基因nArah2，如SEQN0.2 所示； b)利用優(yōu)化基因nArah2進一步構建表面展示表達載體質粒PNZ3； c)利用重組表達質粒轉化乳酸乳球菌并篩選鑒定獲取重組乳酸乳球菌菌株。
6.根據(jù)權利要求5所 述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟b)中構建重組表達質粒PNZ3時包括以L.lactissubsp.cremorisMG1363的基因組DNA為模板，利用引物 PcalF:5’ -TAGGGTACCTCTGGTGGCTCGACAACCACAATTAC-3’ 和 PcalR:5’ -CCGCAAGCTITTAITTTAITCGTAGATACTGACCAATT-3’ PCR 擴增-cwa 序列；利用引物 PsplF:5’ -CCGGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3’ 和 Pral，R:5，-CGGGGTACCATAACGATCACGACCACCT-3，PCR 擴增-SPusp45-nArah2融合序列的步驟。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備重組乳酸乳球菌菌株的方法，其特征在于步驟c)中的轉化方法是電轉化。
【文檔編號】C12R1/01GK103614331SQ201310646560
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權日:2013年12月4日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張秋香, 任晟誠, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請人:江南大學