產量提高的植物的制作方法

產量提高的植物的制作方法
【專利摘要】本發明一般涉及通過提高一種或多種增強植物中氮利用效率相關之多肽的活性而獲得的與相應未轉化野生型植物細胞相比具有增強的氮利用效率和/或提高的生物量產生的植物細胞。
【專利說明】產量提高的植物
[0001]本申請是申請日為2008年9月17日、發明名稱為“產量提高的植物”的中國專利申請200880116390.1(國際申請號PCT/EP2008/062362)的分案申請。
[0002]本申請通過參考并入2007年9月18日提交的EP07117448.6以及2008年7月25日提交的 EP08161134.5。
[0003]本發明涉及分子生物學、植物遺傳學、植物生理學和發育生物學領域。更具體地，本文公開的發明提供了含有 增強或提高轉基因植物的一種或多種性狀之核酸的植物細胞、包含這些細胞的植物、來自這些植物的后代、種子和花粉，以及產生和使用這些植物細胞或植物、后代、種子或花粉的方法。特別地，所述提聞的性狀表現為提聞的廣量，優選提聞的一種或多種產量相關性狀.[0004]在大田條件下，植物的性能(例如在生長、發育、生物量累積和種子產生方面的性能)取決于植物對多種環境條件、改變和脅迫的耐性和適應能力。自從農業和園藝起源以來，在作物栽培中就存在對改進植物性狀的需要。除了通過作物栽培的技術發展來提高產量以外，育種策略產生了抵抗生物及非生物脅迫的作物特性，以提高養分使用效率和改變其他作物特異性產量參數。改善了植物的固有生長及發育特征，并引入了對生物及非生物脅迫的耐性，以在環境脅迫條件下維持產量，并擴展不同氣候條件下的栽培面積。開發了具有更好的養分利用效率的作物，以減少肥料輸入，并將栽培面積擴展到土壤養分貧瘠的地區。
[0005]植物是固著生物，因此需要應對各種環境脅迫。生物脅迫(如植物害蟲和病原體)和非生物脅環境迫是植物生長和生產力的重要限制因素(Boyer, Plant Productivity andEnvironment, Science218, 443 - 448(1982);Bohnert 等,Adaptations to EnvironmentalStresses, Plant Cell7 (7)，1099-1111 (1995))，因此限制了植物的栽培和地理分布。接觸不同脅迫的植物通常具有較低產量的植物材料、種子、果實和其他產品。由這些脅迫導致的作物損失和作物產量損失(如水稻、玉蜀黍(玉米)、油菜(包括冬季油菜和蕓苔)、棉花、大豆和小麥)代表了重要的經濟和政治因素，并造成了食品短缺，特別是在許多不發達國家中。
[0006]目前進行作物及園藝改進的常規方法利用選擇性育種技術來鑒定具有期望特征的植物。然而，這些常規技術具有一些缺點。含有異源遺傳組分的植物常常不總能產生從親本植物中傳遞過來的期望性狀，特別是在不產生其他負影響的情況下。因此，特別復雜的性狀(如產量和脅迫現象)使得通過常規育種方法進行遺傳優化十分困難、昂貴且耗時。相反，分子生物學的發展使得可以以特異性方式修飾植物的種質。例如，在一些情況下，對單基因的修飾導致例如脅迫耐性(Wang等，2003)和其他產量相關性狀顯著提高。由于不同的植物在不同栽培地區需要抵抗不同類型和強度的脅迫，因此仍需要鑒定顯示多種脅迫抗性組合的基因來產生優化的產量。仍需要鑒定能從總體上提高植物產量的基因。
[0007]本發明提供了包含一種或多種增強或改進轉基因植物一種或多種性狀之核酸的轉基因植物細胞核和/或轉基因植物細胞、包含這些細胞的植物、來自這些植物的后代、種子和花粉，以及產生和使用這些植物細胞或植物、后代、種子或花粉的方法。特別地，所述改進的性狀表現為提高的產量。[0008]在一個實施方案中，本發明提供了通過提高或產生選自以下的一種或多種活性來產生這些轉基因植物細胞或植物的方法:2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase)、3_酮固醇還原酶、60S核糖體蛋白、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶、腺苷酸激酶、烷基氫過氧化物還原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α-葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、分裂后期促進復合物(APC)亞基、抗病毒銜接蛋白、芳族氨基酸氨基轉移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特異性磷脂酰肌醇-3激酶復合體蛋白亞基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238_ 蛋白、b2431_ 蛋白、B2646-蛋白、b2766-蛋白、b3120_蛋白、肉堿乙酰基轉移酶、細胞壁內-β_1，3_葡聚糖酶、分子伴侶、幾丁質合酶3復合體蛋白、磷酸膽堿胞苷酰轉移酶、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶(雙功能)、網格蛋白相關蛋白復合體小亞基、RAM信號網絡的組分、半胱氨酸轉運蛋白、細胞色素c氧化酶亞基VII1、胞質溶膠過氧化氫酶、胞質溶膠絲氨酸羥甲基轉移酶、二氫乳清酸脫氫酶、二氫神經鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亞基、因子停滯蛋白、G蛋白偶聯外激素受體受體、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸轉運蛋白亞基、甘氣酸脫竣酶、糖基轉移酶、聞爾基體?旲交換因子亞基、聞爾基體?旲蛋白、GP1-錨著細胞壁蛋白、GTP結合蛋白、與肌醇/膽堿應答元件結合的螺旋-環-螺旋轉錄激活子、己糖轉運蛋白、調節滲透感受MAP激酶級聯的組氨酸激酶滲透感受器、水解酶、羥胺還原酶、羥基十四酰酰基載體蛋白脫水酶、過氧化物酶體遺傳蛋白、定位于晚期高爾基泡的膜內在蛋白、鐵硫簇裝配蛋白、異構酶、賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基、賴氨酸特異性金屬蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp結合轉錄阻抑物、減數分裂重組蛋白、膜蛋白、金屬離子轉運蛋白、微粒體β_酮還原酶、線粒體內膜間隙蛋白、線粒體蛋白、線粒體核糖體蛋白大亞基、線粒體核糖體蛋白小亞基、線粒體絲氨酰-tRNA合成酶、鑰喋呤生物合成蛋白、肌醇轉運蛋白、非必需動粒蛋白、非必需Ras鳥苷酸交換因子、Ras樣蛋白Rho/Rac亞家族的非必需小GTP酶、核帽結合蛋白復合體亞基、核融合蛋白前體、核孔復合體亞基、起點識別復合體亞基、外膜引導蛋白 、氧化還原酶、肽轉運蛋白、肽酰-脯氨酰順反異構酶、PhoH-樣蛋白、磷脂酰絲氨酸脫羧酶、葡糖磷酸變位酶/磷酸甘露糖變位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、鉀:氫反向轉運蛋白、脯氨酸脫氫酶、核糖體大亞基的蛋白質組分、參與shmoo形成和雙極出芽位點選擇的蛋白質、參與鞘脂生物合成的蛋白質、蛋白激酶、含有L-A雙鏈RNA的微粒的結構穩定性所必需的蛋白質、核糖體RNA成熟所需的蛋白質、蛋白質移位酶蛋白、調節性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶的調節性亞基、26S蛋白酶體的調節性亞基、Gl轉錄的阻抑物、Rho GDP-解離抑制子、核糖核蛋白、核糖體蛋白小亞基、RNA聚合酶III亞基、酵母氨酸脫氫酶、短鏈脂肪酸轉運蛋白、信號識別顆粒亞基(SRP54 )、信號轉導MEK激酶、用于mRNA剪接的SM復合體B蛋白、紡錘體檢查點復合體亞基、剪接因子、穩定期蛋白、胞質苯丙氨酰-tRNA合成酶亞基、順面高爾基體轉運蛋白顆粒(TRAPP)復合體亞基、蘇氨酸脫氨酶、轉錄延伸因子、轉錄因子、轉錄激活子、翻譯延伸因子EF-3(HEF3)、在細胞壁多聚體組成中發揮作用的跨膜蛋白、轉運蛋白、泛素調節蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P轉移酶、v-SNARE結合蛋白、參與高爾基體轉運的v-SNARE蛋白、木糖醇脫氫酶、yalO 19w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W蛋白、ygrl22c_a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c 蛋白、yhrl27w 蛋白、YJLOIOC 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKL111C 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C 蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、鋅指蛋白和鋅金屬蛋白酶。
[0009] 在一個實施方案中，通過提高具有選自以下之活性的一種或多種蛋白質的量和/或活性來提高所述活性，并且其中這一種或多種蛋白質各包含如表1I第5列或第7列所示多肽:2_脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸醛縮酶、3-酮固醇還原酶、60S核糖體蛋白、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶、腺苷酸激酶、烷基氫過氧化物還原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α -葡糖苷酶、α -甘露糖苷酶、分裂后期促進復合物(APC)亞基、抗病毒銜接蛋白、芳族氨基酸氨基轉移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特異性磷脂酰肌醇-3激酶復合體蛋白亞基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238_ 蛋白、b2431-蛋白、B2646-蛋白、b2766-蛋白、b3120_蛋白、肉堿乙酰基轉移酶、細胞壁內-β-1，3-葡聚糖酶、分子伴侶、幾丁質合酶3復合體蛋白、磷酸膽堿胞苷酰轉移酶、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶(雙功能)、網格蛋白相關蛋白復合體小亞基、RAM信號網絡的組分、半胱氨酸轉運蛋白、細胞色素c氧化酶亞基VII1、胞質溶膠過氧化氫酶、胞質溶膠絲氨酸羥甲基轉移酶、二氫乳清酸脫氫酶、二氫神經鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亞基、因子停滯蛋白、G蛋白偶聯外激素受體受體、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸轉運蛋白亞基、甘氨酸脫羧酶、糖基轉移酶、高爾基體膜交換因子亞基、高爾基體膜蛋白、GP1-錨著細胞壁蛋白、GTP-結合蛋白、與肌醇/膽堿應答元件結合的螺旋-環-螺旋轉錄激活子、己糖轉運蛋白、調節滲透感受MAP激酶級聯的組氨酸激酶滲透感受器、水解酶、羥胺還原酶、羥基十四酰酰基載體蛋白脫水酶、過氧化物酶體遺傳蛋白、定位于晚期高爾基泡的膜內在蛋白、鐵硫簇裝配蛋白、異構酶、賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基、賴氨酸特異性金屬蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp結合轉錄阻抑物、減數分裂重組蛋白、膜蛋白、金屬離子轉運蛋白、微粒體β_酮還原酶、線粒體內膜間隙蛋白、線粒體蛋白、線粒體核糖體蛋白大亞基、線粒體核糖體蛋白小亞基、線粒體絲氨酰-tRNA合成酶、鑰喋呤生物合成蛋白、肌醇轉運蛋白、非必需動粒蛋白、非必需Ras鳥苷酸交換因子、Ras樣蛋白Rho/Rac亞家族的非必需小GTP 酶、核帽結合蛋白復合體亞基、核融合蛋白前體、核孔復合體亞基、起點識別復合體亞基、外膜引導蛋白、氧化還原酶、肽轉運蛋白、肽酰-脯氨酰順反異構酶、PhoH-樣蛋白、磷脂酰絲氨酸脫羧酶、葡糖磷酸變位酶/磷酸甘露糖變位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、鉀:氫反向轉運蛋白、脯氨酸脫氫酶、核糖體大亞基的蛋白質組分、參與shmoo形成和雙極出芽位點選擇的蛋白質、參與鞘脂生物合成的蛋白質、蛋白激酶、含有L-A雙鏈RNA的微粒的結構穩定性所必需的蛋白質、核糖體RNA成熟所需的蛋白質、蛋白質移位酶蛋白、調節性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶的調節性亞基、26S蛋白酶體的調節性亞基、Gl轉錄的阻抑物、Rho GDP-解離抑制子、核糖核蛋白、核糖體蛋白小亞基、RNA聚合酶III亞基、酵母氨酸脫氫酶、短鏈脂肪酸轉運蛋白、信號識別顆粒亞基(SRP54)、信號轉導MEK激酶、用于mRNA剪接的SM復合體B蛋白、紡錘體檢查點復合體亞基、剪接因子、穩定期蛋白、胞質苯丙氨酰-tRNA合成酶亞基、順面高爾基體轉運蛋白顆粒(TRAPP)復合體亞基、蘇氨酸脫氨酶、轉錄延伸因子、轉錄因子、轉錄激活子、翻譯延伸因子EF-3(HEF3)、在細胞壁多聚體組成中發揮作用的跨膜蛋白、轉運蛋白、泛素調節蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P轉移酶、v-SNARE結合蛋白、參與高爾基體轉運的v-SNARE蛋白、木糖醇脫氫酶、yal019w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W 蛋白、ygrl22c-a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c蛋白、yhrl27w 蛋白、YJL010C 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKLlIIC 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、鋅指蛋白和鋅金屬蛋白酶。
[0010]本發明所述提高的產量一般可通過增強或改善(與未轉化起始植物或野生型植物相比)植物的一種或多種產量相關性狀來實現。導致產量提高的這些對植物產量相關性狀的改善包括但不僅限于提高植物的固有產量能力，改善養分使用效率和/或提高的脅迫耐性。
[0011]根據本發明，與提高植物內在產量能力相關的產量相關性狀可表現為提高的特異性(固有)種子產量(例如提高的種子/籽粒大小、提高的穗數、提高的每穗種子數、改善的種子飽滿度、改善的種子組成、胚和/或胚乳的改進等)、修飾和改進植物的內在生長和發育機制(如植物高度、植物生長率、莢果數、莢果在植物上的位置、節間數、莢果破裂的發生率、結瘤和氮固定的效率、碳同化作用的效率、幼苗活力/早期活力的改進、增強的萌發(在脅迫或非脅迫條件下)效率、植物結構的改進、細胞周期的改變、光合作用的改變、多種信號途徑的改變、轉錄調節的改變、翻譯調節的改變、酶活性的改變等)和/或其他。
[0012]根據本發明，與植物的養分使用效率提高或增加相關的產量相關性狀可表現為改進的植物一般養分同化作用效率(例如一般養分攝入和/或轉運的改進、植物的一般轉運機制的改進、同化作用途徑的改進等)和/或改進特定養分的使用效率，包括但不僅限于磷、鉀和氮。
[0013]根據本發明，與植物脅`迫耐性的改進或提高相關的產量相關性狀可表現為改進或提高植物針對脅迫(特別是非生物脅迫)的耐性。在本申請中，非生物脅迫一般指植物通常面對的非生物環境條件，包括一般稱為“非生物脅迫”條件的條件，包括但不僅限于干旱(對干旱的耐性可通過改進水利用效率來獲得)、熱、低溫和冷條件(如冰凍和寒冷條件)、鹽度、滲透壓脅迫、掩蔽、高植物密度、機械脅迫、氧化脅迫等。
[0014]根據本發明，涉及植物內在產量能力提高和/或植物對非生物脅迫的耐性的產量相關性狀改進是用于增強或改進所述植物產量的特別優選的實施方案。
[0015]本文使用的術語“產量” 一般指來自植物(特別是作物)的可測量的生產。
[0016]產量和產量提高(與未轉化起始植物或野生型植物相比)可通過多種方式來測量，應該理解，本領域技術人員能夠根據具體的實施方案、相關的具體作物以及特定的目的或相關應用來應用正確的含義。
[0017]在本發明優選的實施方案中，產量提高指生物量產量提高、種子產量提高和/或完整植物或其部分或植物種子中一種或多種特定含量的提高。
[0018]在優選的實施方案中，“產量”指生物量產量，包括干重生物量產量和/或鮮重生物量產量，其根據具體的情況(測試條件、特定的目的作物、目的應用等)各自涉及植物的地上部分和/或地下部分。在每種情況下，生物量產量均可基于鮮重、干重或根據濕度調整的基礎來計算，另一方面，可基于每株植物或特定面積(如每英畝/平方米的生物量產量等)來計
笪
[0019]在另一些優選的實施方案中，“產量”指種子產量，其可通過以下一種或多種參數來測量:種子數或飽滿種子數(每株植物或每單位面積(英畝/平方米等))、種子飽滿率(飽滿種子數與種子總數的比值)、每植物的花數、種子生物量或種子總重(每株植物或每單位面積(英畝/平方米等))、千粒重(TKW，由計數的飽滿種子數及其總重來外推，TKW的提高可由種子大小提高、種子重量提高、胚大小提高和/或胚乳提高所致)或者允許測量種子產量的其他參數。種子產量可基于干重或鮮重來計算，或者一般基于濕度調整(如15.5%濕度)來計算。
[0020]在其他優選的實施方案中，產量指可收獲產品中的特定含量和/或組成，包括但不僅限于增強和/或改進的糖含量或糖組成、增強或改進的淀粉含量和/或淀粉組成、增強和/或改進的油含量和/或油組成(如增強的種子油含量)、增強或改進的蛋白質含量和/或蛋白質組成(如增強的種子蛋白質含量)、增強和/或改進的維生素含量和/或維生素組成等。
[0021]在根據本申請的一個優選含義中，本文所述“產量”還可指植物的可收獲產量，其在很大程度上取決于特定的目的植物/作物以及各個特定情況下的預期的目的應用(如食物生產、飼料生產、加工食品生產、生物燃料、沼氣或醇生產等)。因此，產量還可以基于收獲指數(表示為相應可收獲部分重量除以總生物量的比值)、每單位面積(英畝、平方米等)的可收獲部分重量等。
[0022]優選地，本文所述優選的增強或改進的植物產量特征可在存在或不存在脅迫條件的情況下實現。
[0023]因此，“產量”的含義主要取決于目的作物及其預期應用，應該理解，本領域技術人員會明白在各種具體情況下其在環境描述中的含義。
[0024]在本發明的一個優選實施方案中，通過提高一種或多種產量相關性狀來提高植物產量，所述產量相關性狀選自與光合作用活性生物(特別是植物)的養分利用效率相關的一種或多種改進。植物養分利用效率的改進或提高可表現為改進植物的總體養分同化效率(例如改善總體養分攝入和/或轉運，改善植物的總體轉運機制、同化途徑的改進等)和/或改進特定養分(包括但不僅限于磷、鉀和氮)的利用效率。
[0025]術語“養分缺乏”指相應的光合作用生物(特別是植物)缺少養分(如磷、鉀或氮)的條件，特別地，“氮缺乏”指相應光合作用生物(特別是植物)缺少氮的條件。
[0026]在一個優選的實施方案中，本發明涉及對光合作用活性生物(特別是植物)中氮利用效率進行操作。具體地，本發明涉及在光合作用活性生物(特別是植物)中增強氮攝入和/或氮利用的方法。本發明還涉及在光合作用活性生物(特別是植物)中增強生物量產生(特別是在氮有限的條件下)的方法。
[0027]具體地， 本發明涉及適于在氮缺乏條件下生長的植物細胞和/或植物，以及在氮缺乏條件下顯示提高的產量的植物細胞和/或植物。
[0028]本發明還涉及用于產生及篩選及培育這些植物細胞和/或植物的方法。[0029]植物營養對于植物的生長和發育而言是關鍵性的，因此對于植物產品的數量和質量來說也是關鍵性的。由于營養攝入和營養利用的效率對植物產量和產品品質有很大影響，所以在土壤中使用大量肥料來優化植物的生長和品質。
[0030]植物生長主要受限于三種養分一磷、鉀和氮。因此，氮(N)是植物生長所需的主要營養元素之一，通常是植物生長的限速元素。氮是可見于活細胞中的大量重要化合物(如氨基酸、蛋白質(如酶)、核酸和葉綠素)的一部分。植物干物質的1.5%至2%和植物總蛋白的約16%是氮。因此，氮的利用度對氨基酸合成和氨基酸組成、氨基酸累積、蛋白質合成及累積有重大影響，因此是植物生長和產量的重要限制因素(Frink C.R., Proc.Natl.AcadSc1.USA96, 1175(1999))。
[0031]植物可利用多種氮種類，包括氨氣(NH3)、氮氧化物(NOx)、礦物氮(如硝酸鹽(NO3O和銨鹽(NH4+))、尿素及尿素衍生物以及有機氮(氨基酸、肽等)。一些植物能通過共生細菌或某些真菌利用大氣中的氮。然而，在多數農業土壤中，硝酸鹽(N03_)是最重要的氮源(Crawford N.M., Glass A.D.M., Trends in Plant Science, 3389(1998) ; HirschR.E.，Sussman M.R.，TIBTechl7, 356(1999))。盡管如此，銨NH4+也發揮重要的(也許是被低估的)作用，因此多數植物在兩種形式均存在時偏好攝入NH4+,甚至在NH4+的存在濃度低于NOf 時也是這樣(von Wiren N.等，Curr.0pin.Plant Biol.3, 254 (2000)) ?
[0032]由于作物植物的高氮需求，氮肥是十分廣泛的農業投資，每年施用八千萬噸氮肥(硝酸鹽和 / 或銨)(Frink C.R., Proc.Natl.Acad Sc1.USA96, 1175 (1999))。在作物生產中大量使用含氮肥料也有不良的環境后果，因為作物僅保留所施用氮的約三分之二。因此，大量的肥料投入通過淋洗、氣體喪失和作物清除而導致了大量輸出。接著未吸收的氮可被淋洗到土壤中并污染水源(Frink C.R., Proc.Natl.Acad Sc1.USA96, 1175 (1999))。由于大量氮從農業生態系淋洗到地表水和地下水中，氮也被認為是一種污染物。氮淋洗(即作為硝酸鹽從農業田地中淋洗出來)影響飲用水的品質，并導致湖泊和海岸地區的富營養化。大量使用含氮肥料可進一步導致土壤品`質最終惡化、環境污染和衛生危險。
[0033]由于對于農業產品收入而言每年的高氮肥費用及其對環境的有害影響，期望開發出這樣的方法，以減少氮肥投入和/或優化氮攝入和/或對給定氮利用度的利用，而同時維持光合作用活性生物(優選栽培植物，如作物)的最佳產量、生產力和品質。還期望獲得“現有”的作物產量而同時肥料投入更少和/或在類似或甚至更貧瘠的土壤上具有更高的產量。
[0034]對于高效的氮攝入和利用而言，需要涉及氮的吸收、轉運、同化和再分布的復雜過程來有效運行。不同研究人員已經在一些物種中證明了基因型之間氮吸收的差異(Chang
S.C.,Robison D.J., Sc1.World J.，Suppl.2，407 (2001))。還在小麥和蕓苔中報道了氮攝入的基因型差異的可觀證據(Weisler 等,Sc1.World J., Suppl.2, 61 (2001) ;Gallais
A., Hirel B., J.Exper.Bot.55, 295 (2004))。
[0035]植物通過位于根表皮的轉運蛋白和皮層細胞質膜從寬硝酸鹽濃度范圍中吸收硝酸鹽，其中利用了數種不同轉運機制，包括組成型及硝酸鹽誘導型高親和力轉運系統以及硝酸鹽誘導型低親和力轉運蛋白(Stitt M., Curr.0pin.Plant Biol.2，178 (1999))。此外,植物中的硝酸鹽攝入收到其他轉運及代謝途徑的高度調控和協同(Crawford N.M.PlantCell7, 859(1995)),已經鑒定和表征了大量硝酸鹽攝入及同化相關的基因(Forde
B.G., Ann.Rev.Plant Biol53，203 (2002))。一旦進入根細胞胞質之后，硝酸鹽可以存儲在液泡中供以后使用、轉運到木質部并轉移至嫩枝用于同化和/或存儲、釋放回根際中或者通過硝酸鹽還原酶(NR)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)還原成亞硝酸鹽并接著還原成氨。硝酸鹽還原成亞硝酸鹽并接著還原成氨使得氮通過GOGAT途徑被同化進氨基酸中(StittΜ.，Curr.0pin.Plant Biol.2, 178(1999))。為了摻入氨基酸、核酸及其他化合物中，N03_必須被還原成NH4+。NR (硝酸鹽還原酶)是NOf還原成NH4+的過程中的第一種酶。它是底物誘導型的酶，并被認為是氮同化中最限制速度的步驟。[0036]N03_還原的原位速率主要受N03_攝入速率的控制，而不是硝酸鹽還原酶活性(NRA)的改變或還原力限制的控制。因此，no3_攝入看來在no3_喂飼植物的氮同化中是最重要的。NRA的遺傳改變已在若干物種中充分證實。NRA受到諸如以下的因素的影響:環境條件和植物發育階段以及植物部分(如根和頂部)。此外，體內和體外測定通常給出不同的結果。在若干研究者將NRA與谷粒產量及N相關性狀(如總還原植物氮、谷粒氮含量、谷粒氮濃度和氮收獲指數)相關聯的嘗試中獲得了不同的結果。
[0037]除了 N03_以外，植物還能攝入銨形式的氮。盡管土壤中的平均NH4+濃度經常比 NOf 的濃度低 10 至 1000 倍(Marschner H.L., “Mineral Nutrition in HigherPlants” , London, Academic Press, 1995),但土壤濃度的差異不必然反映各種氮源的攝入比例。當兩種形式(N03_和NH4+)均可用時，植物偏好攝入NH4+,可能是因為其同化需要的能量更少，因為NO3-在同化之前必須先被還原(Bloom等，Plant Phys.1294-1301(1992))。
[0038]已經在不同生物(包括酵母和植物)中表征了銨攝入系統。釀酒酵母含有用于銨轉運蛋白的三個MEP基因，它們均受氮控制，在存在易于代謝的氮源(如NH4+)時被抑制(Marini等，Mol.Cell Biol.17,4282(1997))。已經通過酵母突變體的互補、數據庫同源性檢索和異源雜交克隆了編碼銨轉運系統的植物基因(von Wiren N.等，Curr.0pin.PlantBiol.，3，254(2000))。NH4+轉運蛋白生理功能的實驗性證據主要依賴于銨轉運蛋白表達與標記的銨的內向通量之間的相關性。在擬南芥和其他植物中，銨轉運蛋白以基因家族存在，其成員具有不同的表達模式和生理特征，這一事實使得情況變得復雜。DE4337597要求保護植物銨轉運蛋白的序列及其用于在某些情況下對氮代謝和植物生長進行操作的用途，但并沒有通過異位表達植物銨轉運蛋白獲得的在某些條件下對氮同化或植物生長的正影響的任何證據。
[0039]無機氮同化成有機形式的第一步通常包括谷氨酰胺合酶催化的谷氨酸與氨形成谷氨酰胺的反應。因此，所形成的谷氨酰胺可進而將酰氨基中的氨官能團轉移至天冬氨酸而形成天冬酰胺，由天冬酰胺合酶催化。氮從氨向天冬酰胺的穩定流動依賴于谷氨酸、α -酮戊二酸和天冬氨酸之間的循環，由谷氨酰胺-2-酮戊二酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶催化。谷氨酰胺和天冬酰胺代表了植物中主要的長距離“氮轉運化合物”。它們在韌皮部樹液中很豐富，但它們在植物氮代謝中卻具有一些不同的作用，因為谷氨酰胺更具代謝活性，這是基于以下事實，它可直接將其酰氨基中的氨官能團轉移至多種底物上，而天冬酰胺在“氮轉運和存儲”中更有效。
[0040]已知有不同的方法來描述光合作用生物中氮完整途徑的效率——從氮從土壤中攝入開始、同化、含氮化合物的轉運和累積、對生物量和產量的影響。鑒于優化氮利用的重要性，已進行了不同的策略來進行植物優化。
[0041]在一些情況下，氮同化途徑中的酶(如谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶和天冬酰胺酶)被過表達。盡管開始并不成功，像在蓮花中過表達胞質谷氨酰胺合成酶(Vincent R.等，Planta201，424 (1997))，但最近的文獻顯示了至少在一定程度上的成功。W095/09911描述了在轉基因植物中過表達谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶和天冬酰胺酶，以用于增強氮固定和提高產量。Chichkova等在J.Exp.Bot.，52，2079 (2001)中報道，過表達苜蓿NADH-谷氨酸合酶的轉基因煙草具有更高的碳和氮含量，但氮與碳相比并未特別富集。在另一情形中，氮同化基因的過表達(在這一情形中為大腸桿菌谷氨酸脫氫酶)未導致氮含量的相對提高，而是導致鮮重和干重顯著提高。在另一情形中，ASNl基因的過表達增強了擬南芥種子中的氮狀態(Lam H.等，Plant Physiol.321，926 (2003))。在這些過表達品系的種子中，作者觀察到可溶性種子蛋白質含量的提高、酸水解種子中總蛋白含量的提聞以及幼苗在氣有限條件下生長時耐性的提聞。
[0042]Yanagisawa等，PNAS101，7833 (2004)實施了另一種有趣的方法。該作者使用轉錄因子Dofl。該調節因子的過表達誘導了轉基因擬南芥中編碼碳骨架產生之基因的上調、氨基酸含量顯著提高以及葡萄糖含量減少。元素分析顯示，轉基因植物中的氮含量提高(約30%)，表明對氮凈同化的促進。更重要的是，Dofl轉基因植物顯示出在低氮條件下改善的生長。盡管看起來很有前景，但該方法很可能具有這樣的缺點，即其依賴于植物轉錄因子和復雜的相應信號級聯，它們都是不同內部調節及反饋機制的對象，這至少在某些情況下改變或甚至消除了期望的效果。
[0043]因此，仍需要這樣的光合作用活性生物(特別是植物)，其能夠更有效地利用氮，從而獲得與目前的氮利用水平下相同的產量或更高的產量所需的氮更少。此外，仍需要顯示提高的生物量和/或產量的 光合作用活性生物，特別是植物。
[0044]因此，本發明的一個目的是開發在光合作用生物中增強氮攝入和/或轉運和/或同化和/或利用(其單獨或共同反映為提高的氮利用效率(NUE))的廉價方法和/或提高在氮供應有限的條件下的生物量產生和/或產量的方法。
[0045]我們發現，這一目的通過提供本文所述的方法而得以實現。
[0046]本發明的另一個目的是提供與相應的未轉化野生型植物細胞和/或植物相比，顯示增強的NUE和/或在氮供應有限條件下顯示提高的生物量產生和/或產量的植物細胞和/或植物。
[0047]我們發現，這一目的通過提供本文所述發明的植物細胞和/或植物而得以實現。
[0048]在本發明的一個實施方案中，這些性狀通過在光合作用活性生物(優選植物)中與相應未轉化野生型光合作用活性生物相比增強氮利用(=氮利用效率(NUE))的方法來獲得。
[0049]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，在正常條件下或低營養條件下顯示出總體增強的產量(如上文所定義)，尤其是增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)生物量產量。
[0050]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)干生物量產量。
[0051]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)地上干生物量產量。
[0052]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)地下干生物量產量。
[0053]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)鮮重生物量產量。
[0054]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)地上鮮重生物量產量。
[0055]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)地下鮮重生物量產量。
[0056]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物可收獲部分產量。
[0057]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物干可收獲部分產量。
[0058]在其一個實施方案中`，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物干地上可收獲部分產量。
[0059]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物干地下可收獲部分產量。
[0060]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物可收獲部分鮮重產量。
[0061]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物地上可收獲部分鮮重產量。
[0062]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)植物地下可收獲部分鮮重產量。[0063]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)作物果實產量。
[0064]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)鮮作物果實產量。
[0065]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)干作物果實產量。
[0066]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮谷粒干重，類似于Reynolds, Μ.P., Ortiz-Monasterio J.J.和 McNab A.(eds.), 2001, “Application ofPhysiology in Whaet Breeding, Mexico, D.F.:CIMMYT,其通過引用并入本文。
[0067]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)種子產量。
[0068]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)種子鮮重產量。
[0069]在其一個實施方案中，術語“增強的NUE”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出增強的每單位氮(來自該光合作用活性生物(優選植物)所生長的周圍培養基、土壤或環境，包括氮肥)種子干重產量。
[0070]在本發明的另一實施方案中，這些性狀通過與相應未轉化野生型光合作用活性生物相比，在光合作用活性生物(優選植物)中提高在氮供應有限條件下的生物量產生和/或產量的方法來實現。
[0071]在其一個實施方案中，術語“提高的生物量產生”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應的野生型光合作用活性生物相比，顯示出在氮供應有限條件下提高的生長速率。提高的生長速率可反映為提高的完整植物生物量產生，或者提高的植物地上部分生物量產生，或者提高的植物地下部分生物量產生，或者提高的植物部分(如莖、葉、花、果實、種子)生物量產生。
[0072]在其一個實施方案中，提高的生物量包括更高的果實產量、更高的種子產量、更高的鮮物質產生和/或更高的干物質產生。
[0073]在另一實施方案中，術語“提高的生物量產生”指該光合作用活性生物(優選植物)與相應未轉化野生型光合作用活性生物相比，顯示出在氮供應有限條件下延長的生長。延長的生長包括在未轉化野生型光合作用活性生物顯示可見的缺乏癥狀和/或死亡時，該光合作用活性生物(優選植物)存活和/或繼續生長。 [0074]在本發明的一個實施方案中，根據以下方法對增強的NUE進行測定和定量:
[0075]在培養室(Svalof ffeibull, Svalov , Sweden)中的盆中培養轉化植物。在植物為擬南芥的情況下，將其種子種在盆中，其中含有營養缺乏土((“Einheitserde TypO”, 30%粘土，Tantau，Wansdorf Germany))和沙子的1:1 (v: v)混合物。通過黑暗中4*?下的4天時間來誘導萌發。隨后植物生長在標準生長條件下。在植物為擬南芥的情況下，標準培養條件為:16小時光照和8小時黑暗的光周期、20°C、60%相對濕度、200 μ E/m2S的光子通量密度。培養并栽培植物。在植物為擬南芥的情況下，每隔一天用N缺乏營養液澆水。N缺乏營養液例如在水中含有以下礦物養分，但不含其他含氮的鹽:
[0076]
【權利要求】
1.產生與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其通過提高或產生選自以下的一種或多種活性來實現:3_酮固醇還原酶、60S核糖體蛋白、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶、腺苷酸激酶、烷基氫過氧化物還原酶、烷基/芳基硫酸酯酶、α -葡糖苷酶、α -甘露糖苷酶、分裂后期促進復合物(APC)亞基、抗病毒銜接蛋白、芳族氨基酸氨基轉移酶I1、ARVl蛋白、自吞噬特異性磷脂酰肌醇-3激酶復合體蛋白亞基、b0017-蛋白、B0165-蛋白、B1258-蛋白、B1267-蛋白、B1381-蛋白、bl933_ 蛋白、b2165_ 蛋白、b2238-蛋白、b2431-蛋白、B2646-蛋白、b2766_蛋白、b3120_蛋白、肉堿乙酰基轉移酶、細胞壁內-1，3-葡聚糖酶、分子伴侶、幾丁質合酶3復合體蛋白、磷酸膽堿胞苷酰轉移酶、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶(雙功能)、網格蛋白相關蛋白復合體小亞基、RAM信號網絡的組分、半胱氨酸轉運蛋白、細胞色素c氧化酶亞基VII1、胞質溶膠過氧化氫酶、胞質溶膠絲氨酸羥甲基轉移酶、二氫乳清酸脫氫酶、二氫神經鞘氨醇磷酸酯裂合酶、核糖核酸外切酶、F1F0ATP合酶β亞基、因子停滯蛋白、G蛋白偶聯外激素受體受體、Y-谷氨酰激酶、葡糖淀粉酶、甘油-3-磷酸轉運蛋白亞基、甘氨酸脫羧酶、糖基轉移酶、高爾基體膜交換因子亞基、高爾基體膜蛋白、GP1-錨著細胞壁蛋白、GTP結合蛋白、與肌醇/膽堿應答元件結合的螺旋-環-螺旋轉錄激活子、己糖轉運蛋白、調節滲透感受MAP激酶級聯的組氨酸激酶滲透感受器、水解酶、羥胺還原酶、羥基十四酰酰基載體蛋白脫水酶、過氧化物酶體遺傳蛋白、定位于晚期高爾基泡的膜內在蛋白、鐵硫簇裝配蛋白、異構酶、賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸轉運蛋白亞基、賴氨酸特異性金屬蛋白酶、溶血磷脂酶、Mcmlp結合轉錄阻抑物、減數分裂重組蛋白、膜蛋白、金屬離子轉運蛋白、微粒體β_酮還原酶、線粒體內膜間隙蛋白、線粒體蛋白、線粒體核糖體蛋白大亞基、線粒體核糖體蛋白小亞基、線粒體絲氨酰-tRNA合成酶、鑰喋呤生物合成蛋白、肌醇轉 運蛋白、非必需動粒蛋白、非必需Ras鳥苷酸交換因子、Ras樣蛋白Rho/Rac亞家族的非必需小GTP酶、核帽結合蛋白復合體亞基、核融合蛋白前體、核孔復合體亞基、起點識別復合體亞基、外膜引導蛋白、氧化還原酶、肽轉運蛋白、肽酰-脯氨酰順反異構酶、PhoH-樣蛋白、磷脂酰絲氨酸脫羧酶、葡糖磷酸變位酶/磷酸甘露糖變位酶、磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、鉀:氫反向轉運蛋白、脯氨酸脫氫酶、核糖體大亞基的蛋白質組分、參與shmoo形成和雙極出芽位點選擇的蛋白質、參與鞘脂生物合成的蛋白質、蛋白激酶、含有L-A雙鏈RNA的微粒的結構穩定性所必需的蛋白質、核糖體RNA成熟所需的蛋白質、蛋白質移位酶蛋白、調節性CAT8蛋白、Glc7pl型蛋白絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶的調節性亞基、26S蛋白酶體的調節性亞基、Gl轉錄的阻抑物、Rho GDP-解離抑制子、核糖核蛋白、核糖體蛋白小亞基、RNA聚合酶III亞基、酵母氨酸脫氫酶、短鏈脂肪酸轉運蛋白、信號識別顆粒亞基(SRP54)、信號轉導MEK激酶、用于mRNA剪接的SM復合體B蛋白、紡錘體檢查點復合體亞基、剪接因子、穩定期蛋白、胞質苯丙氨酰-tRNA合成酶亞基、順面高爾基體轉運蛋白顆粒(TRAPP)復合體亞基、蘇氨酸脫氨酶、轉錄延伸因子、轉錄因子、轉錄激活子、翻譯延伸因子EF-3(HEF3)、在細胞壁多聚體組成中發揮作用的跨膜蛋白、轉運蛋白、泛素調節蛋白、UDP-N-乙酰基-葡糖胺-1-P轉移酶、v-SNARE結合蛋白、參與高爾基體轉運的v-SNARE蛋白、木糖醇脫氫酶、yal019w蛋白、ybr262c蛋白、YDR070C蛋白、ydr355c蛋白、YFR007W 蛋白、ygrl22c-a 蛋白、ygr266w 蛋白、ygr290w 蛋白、YHL005C 蛋白、yhl021c蛋白、yhrl27w 蛋白、YJL010C 蛋白、yjl064w 蛋白、yjl067w 蛋白、yjl213w 蛋白、ykllOOc 蛋白、YKLlIIC 蛋白、ykll31w 蛋白、ykr016w 蛋白、ykr021w 蛋白、yll014w 蛋白、y11023c 蛋白、yll037w 蛋白、yll049w 蛋白、ylr042c 蛋白、YLR053C 蛋白、ylr065c 蛋白、ylrl25w 蛋白、ylr404w 蛋白、ylr463c 蛋白、yml089c 蛋白、YML101C 蛋白、ymll28c 蛋白、YMR082C 蛋白、YMR126C 膜蛋白、YMR144W 蛋白、YMR160W 蛋白、YMR209C 蛋白、YMR233W 蛋白、YNL320W 蛋白、Y0R097C蛋白、Y0R203W蛋白、YPL068C蛋白、鋅指蛋白和鋅金屬蛋白酶。
2.產生與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其通過提高或產生至少一種多肽的活性來實現，所述多肽包含選自以下的多肽: (i)分別包含表1I或表1V第5或7列所示多肽、共有序列或至少一種多肽基序的多肽；或 (ii)包含表1第5或7列所不多核苷酸之核酸分子的表達產物；或 (iii)(i)或(ii)的功能等同物。
3.產生與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其通過提高或產生至少一種核酸分子的 ⑴表達;和/或 (ii)表達產物的表達；和/或 (iii)所編碼的表達產物的活性 來實現，所述核酸分子包含選自以下的核酸分子: Ca)編碼表1I第5或7列所示多肽的核酸分子； (b)表1第5或7列所示核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遺傳密碼的簡并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提聞的生物量廣生； (d)核酸分子,其與包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (e)核酸分子，其編碼與(a)至(C)所述核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生。
4.權利要求1的方法，其中所述提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生通過提高或產生包含權利要求2所述多肽之至少一種多肽的活性來賦予，和/或通過提高或產生包含權利要求3所述核酸分子的至少一種核酸分子的活性來賦予。
5.權利要求2的方法，其中所述提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生通過提高或產生包含權利要求3所述核酸分子的至少一種核酸分子的活性來賦予。
6.產生與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的氮利用效率(NUE)和/或提高的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其通過用核酸分子轉化植物細胞或植物細胞核或植物組織并且從所轉化的植物細胞核、植物細胞或植物組織再生具有提高的產量的轉基因植物來實現，所述核酸分子包含選自以下的核酸分子: Ca)編碼表1I第5或7列所示多肽的核酸分子； (b)表1第5或7列所示的核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遺傳密碼的簡并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提聞的生物量廣生； (d)核酸分子,其與包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (e)核酸分子，其編碼與(a)至(C)所述核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子的活性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生。
7.權利要求1至5中任一項的方法，其導致與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比在標準生長條件下具有提高的產量。
8.分尚的核酸分子，其包含選自以下的核酸分子: Ca)編碼表1I B第5或7列所示多肽的核酸分子；` (b)表1B第5或7列所示的核酸分子； (c)核酸分子，其可由于遺傳密碼的簡并性而衍生自表1I第5或7列所示多肽序列，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提聞的生物量廣生； (d)核酸分子,其與包含表1第5或7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%同一性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (e)核酸分子，其編碼與(a)至(C)所述核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少30%同一性的多肽，并具有包含表1第5列所述多核苷酸的核酸分子的活性，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (f)核酸分子，其在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (g)核酸分子，其編碼可借助于針對表(a)至(e)核酸分子之一所編碼多肽而產生的單克隆或多克隆抗體來分離的多肽，并具有包含表1第5列所示多核苷酸的核酸分子代表的活性； (h)核酸分子，其編碼包含表1V第7列所示共有序列或者一種或多種多肽基序的多肽，并優選具有包含表1I或IV第5列所示多核苷酸的核酸分子代表的活性； (i)核酸分子，其編碼具有表1I第5列所示蛋白質之活性的多肽，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生； (j)核酸分子，其包含通過用表1II第7列所示引物擴增cDNA文庫或基因組文庫而獲得的多核苷酸，并優選具有包含表1I或IV第5列所不多核苷酸的核酸分子代表的活性； 和 (k)核酸分子，其可通過在嚴格雜交條件下篩選合適的核酸文庫而獲得，其中使用包含(a)或(b)之核酸分子的互補序列的探針，或者使用其片段，所述探針或片段具有與(a)至Ce)所表征核酸分子序列互補的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并編碼多肽，所述多肽具有包含表1I第5列所示多肽的蛋白質的活性。
9.核酸分子，其在表1A第5或7列所不序列的至少一個或多個核苷酸中與權利要求8所述核酸分子不同，并優選編碼與表1IA第5或7列所示蛋白質序列存在至少一個或多個氨基酸差異的蛋白質。
10.核酸構建體，其賦予權利要求8或9所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子的表達，包含一個或多個調節元件，特別是其中所述核酸在宿主細胞中的表達導致與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生。
11.載體，其包含權利要求8或9所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子或者權利要求10所述核酸構建體，特別是所述編碼核酸在宿主細胞中的表達導致與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生。
12.宿主細胞，其已經穩定或瞬時轉化了權利要求11所述載體或者權利要求8或9所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子或者權利要求10所述核酸構建體，特別是由于所述轉化而顯示出與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生。
13.用于產生多肽的方法，其中所述多肽在權利要求12所述宿主細胞中表達。
14.多肽，其通過權利要求13的方法產生，或者由權利要求8或9所述核酸分子編碼，或者由權利要求6所述核酸分子編碼，其中所述多肽與表1IA所示序列存在一個或多個氨基酸的差異，特別是如表1IB所不。
15.與權利要求14所述多肽特異性結合的抗體。
16.轉基因植物細胞核、植物細胞、植物組織、繁殖材料、收獲材料、植物或其部分，其包含權利要求8或9所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子或者權利要求12所述宿主細胞。
17.再生植物后得到的轉基因植物細胞核、植物細胞、植物組織、繁殖材料、收獲材料或植物部分，所述植物與相應未轉化野生型相比具有提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生，或者與相應未轉化野生型相比具有提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生的轉基因植物，其通過權利要求1至7的方法產生，或者轉化了權利要求8或9所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子或者權利要求10所述核酸構建體。
18.權利要求17的轉基因植物細胞、植物或其部分，其來自單子葉植物。
19.權利要求17的轉基因植物細胞、植物或其部分，其來自雙子葉植物。
20.權利要求17的轉基因植物細胞、植物或其部分，其中所述植物選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、水稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽，包括蕓苔和冬季油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亞麻、琉璃苣、紅花、亞麻子、報春花、油菜籽、蘿卜、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、煙草、茄子、西紅柿、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬物種、油棕櫚、椰子、多年生草本植物、飼料作物和擬南芥。
21.權利要求17的轉基因植物細胞、植物或其部分，其中所述植物選自玉米、大豆、油菜(包括蕓苔和冬季油菜)、棉花、小麥和水稻。
22.由權利要求16至21中任一項的轉基因植物產生的種子，其中所述種子對于賦予與相應未轉化野生型相比提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生的轉基因而目是基因純合的。
23.用于鑒定在轉基因植物細胞、植物或其部分中賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生的化合物的方法，包括以下步驟: (a)培養轉基因植物細胞、植物或其部分或者維持轉基因植物，其表達權利要求8或9之核酸分子編碼或者由權利要求6之核酸分子編碼的多肽，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分、任選地未轉化野生型植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生；以及讀數系統，其能在合適條件下與多肽相互作用，所述條件允許該多肽與所述讀數系統在化合物或含有多種化合物之樣品存在下相互作用，并且其能夠應答于化合物與所述多肽在允許表達所述讀數系統及多肽的條件下的結合而提供可檢測的信號，所述多肽由權利要求8或9的核酸分子編碼，或者由權利要求6所述核酸分子編碼，并賦予與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分、未轉化野生型植物或其部分相比提高的產量，特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生；` (b)通過檢測所述讀數系統所產生信號的存在與否或提高來鑒定化合物是否是有效的激動劑。
24.用于產生農用組合物的方法，其包括權利要求23的步驟以及將權利要求23所鑒定化合物配制成可農業應用可接受的形式。
25.組合物，其包含權利要求8或9中任一項所述核酸分子或者權利要求6所述核酸分子、權利要求14所述多肽、權利要求2所述多肽、權利要求10所述核酸構建體、權利要求11所述載體、權利要求24所述化合物和/或權利要求15所述抗體，并任選地包含可農用載體。
26.權利要求14所述分離的多肽，特別是表11、優選表1IB所示多肽，并且其選自酵母、優選釀酒酵母，或選自大腸桿菌。
27.產生與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生的轉基因植物細胞、植物或其部分的方法，其中所述提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生通過表達權利要求14之核酸所編碼多肽來提高，或者通過表達權利要求2所述多肽來提高，并導致與相應未轉化野生型植物細胞、植物或其部分相比具有提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生，該方法包括: (a)用權利要求11的表達載體或者包含權利要求6所述核酸分子的表達載體轉化植物細胞或植物的部分，和(b)從所述植物細胞或植物的部分產生與相應未轉化野生型植物相比具有提高的產量、特別是增強的NUE和/或提高的生物量產生的轉基因植物。
【文檔編號】C12N9/00GK103695459SQ201310645800
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2008年9月17日 優先權日:2007年9月18日
【發明者】P·普齊奧, O·布萊辛, O·蒂姆, G·里特, H·舍恩 申請人:巴斯夫植物科學有限公司