一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法

一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法
【專利摘要】本發明公開一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法，該方法通過以下工藝步驟：(1)多重結晶；(2)活化；(3)鹽析；(4)超濾；(5)熱原處理；(6)透析；(7)親和層析；(8)凍干，制備糜蛋白酶。本發明對糜蛋白酶的生產工藝進行不斷改進，特別是對各工藝參數進行反復的實驗研究，不斷優化，最終確立了一套更為科學的規模化生產工藝，經親和層析純化所得的糜蛋白酶的效價高達1500～1800iu/mg，并且各項指標均符合中國藥典規定。
【專利說明】一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地說涉及一種應用多重結晶、活化、鹽析、透析、親和層析等純化糜蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002]糜蛋白酶又稱胰凝乳蛋白酶，分子量為42000道爾頓，用于肽鏈的酶解，專門水解肽鍵，屬于肽鏈內切酶，水解產率很高，但其專一性小于胰蛋白酶。其固體狀態較穩定，呈白色棒狀結晶；而水溶液極不穩定，pH在5~8時，其活力最強，也最易失去活性。
[0003]糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強、毒性低、不良反應小。一般用于手術后創口或創傷愈合、抗炎及防止局部積血、水腫、扭傷血腫、乳房手術后局部腫脹、鼻炎、中耳炎等。也可用于白內障摘除、松解睫狀肌韌帶，以減少膜破裂和視網膜損傷。此外，糜蛋白酶與胰蛋白酶或其他化學藥劑共同治療各種炎癥具有協同作用，故常用于外科創傷及眼睛消腫治療。
[0004]本發明人自2008年開始對糜蛋白酶的生產工藝進行試驗研究，特別是在生產過程中，不斷探索，通過改變條件的多重結晶，使糜蛋白酶效價高達1500~1800iu/mg,生產工藝穩定，質量可控。

【發明內容】

[0005] 本發明提供了一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法，是為了解決糜蛋白酶提取工藝蛋白活性損失嚴重的缺點，通過改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析純化糜蛋白酶，較好的保持蛋白活性。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現:
[0007]一種親和層析純化糜蛋白酶的方法，其特征在于:改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析等現代生物分離技術，將糜蛋白酶效價提高到1500~1800iu/mg,更好的保持了蛋白的活性。在發明技術方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
[0008]I)多重結晶
[0009]1.1)結晶 I
[0010]核對糜蛋白酶原重量，加糜蛋白酶原重量7倍(w/v)純化水攪拌溶解，加入少許硫酸攪拌，調節pH值至2.5~3.5 ;按2倍糜蛋白酶原重量(w/v)加入飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5~5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅；
[0011]1.2)結晶 II
[0012]加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調節pH值至2.5~3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5~5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅；
[0013]1.3)結晶 III[0014]加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調節pH值至2.5~3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5~5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅，濾液作母液回收；
[0015]1.4)母液回收 III
[0016]量取母液體積，調節pH值至2.5~3.5，按硫酸銨:母液=305g:1L的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解；
[0017]1.5)結晶 IV
[0018]加濾餅重量3倍量(w/v)的純化水溶解，調節pH值至2.5~3.5 ;加濾餅重量I倍量(w/v)飽和硫酸銨溶液，攪拌，調節pH值至4.5~5.5，置于25°C條件下，保溫，過濾，收集濾餅，濾液作母液回收；
[0019]1.6)母液回收IV
[0020]量取母液體積，調節pH值至2.5~3.5，按硫酸銨:母液=305g:1L的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解；
[0021]2)活化
[0022]稱量濾餅重量，加3倍量純化水溶解，調節pH值至7.0~9.0 ;加入濾餅重量I倍量的(w/v)磷酸緩沖液， 攪拌，調節pH值至7.0~9.0。加入胰蛋白酶活化，置于冰箱中，兩天后調節PH值至7.0~9.0 ;
[0023]3)鹽析
[0024]活化液調節pH值至3.0~5.0，加入固體硫酸銨，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅；
[0025]4)超濾
[0026]加入濾餅重量15倍量的(w/v)磷酸鹽緩沖液，攪拌,調節pH值至7.0~9.0，待液體超濾，體積控制在3/10 ；
[0027]5)熱原處理
[0028]5.1)取超濾液，按50:5:3的比例，先后加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液；
[0029]5.2)調節pH值至8.0~10.0,攪拌,離心,棄去沉淀物,取濾液,準備透析扎包；
[0030]6)透析工序
[0031 ] 取濾液，透析液扎包，放入純化水中，進行透析交換，透析4~6天；
[0032]7)親和層析
[0033]7.1)用適量的含 0.5-3mol/L (NH4)2SO4 的 0.01-0.3mol/L，PH3_8 的 NaAc-HAc 緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0034]7.2)將透析液流經此柱，流速控制在I~5mL/min左右；
[0035]7.3)平衡后，用0.5-3mol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
[0036]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡緩沖液洗脫，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脫液，_20°C保存；
[0037]8)凍干
[0038]調節pH值至5.5~6.5，裝盤、凍干，得糜蛋白酶。
[0039]經檢測，所得糜蛋白酶效價約為1500~1800iu/mg。
[0040]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
[0041]選用改變條件的多重結晶，結合超濾、透析、親和層析等現代生物分離技術純化糜蛋白酶，可以使其理化性質和生物活性在后續生產過程中保持穩定，最終使糜蛋白酶的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得糜蛋白酶效價提高到1500~1800iu/mg,節約成本,提高了經濟效益。
【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0043]實施例1
[0044]I)多重結晶
[0045]1.1)結晶 I
[0046]將30kg糜蛋白酶原投入反應罐中，加入210L純化水攪拌溶解，加2.5mol/L硫酸500mL攪拌8小時后，再用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5 ;加入飽和硫酸銨溶液60L，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至4.5，置于25°C條件下，恒溫48小時后過濾，收集濾餅
23.6kg ； [0047]1.2)結晶 II
[0048]將所得濾餅投入反應罐中，加70.8L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.0 ;加23.6L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.0，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅20.5kg ；
[0049]1.3)結晶 III
[0050]將所得濾餅投入反應罐中，加61.5L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.5 ;加20.5L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.5，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅15.4kg，濾液作母液回收；
[0051]1.4)母液回收 III
[0052]量取母液體積84.3L，用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5，加入固體硫酸銨25.71kg,攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.4kg ；
[0053]1.5)結晶 IV
[0054]合并所得濾餅投入反應罐中，加53.4L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5 ;加17.8L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.0，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅13.3kg，濾液作母液回收；
[0055]1.6)母液回收IV
[0056]量取母液體積71.9L，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.5，加入固體硫酸銨21.93kg,攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.1kg ；
[0057]2)活化
[0058]合并所得濾餅投入反應罐中，加46.2L純化水溶解，加2.5mol/L硫酸助溶，用5mol/L NaOH調節pH值至7.0 ;加入15.4L磷酸緩沖液，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至7.5，得料液62.5L。加入胰蛋白酶晶體12.5g，置于4°C冰箱中，兩天后用5mol/L NaOH調節pH值至8.0，得活化液59.2L ；
[0059]3)鹽析
[0060]上述活化液用2.5mol/L硫酸調節pH值至4.0,加入固體硫酸銨29.6kg，靜置過夜,次日過濾,收集濾餅12.4kg ；[0061]4)超濾
[0062]將所得濾餅投入反應罐中，加入磷酸鹽緩沖液186L，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調節PH值至8.5，待液體超濾，體積控制在3/10，得超濾液188L ；
[0063]5)熱原處理
[0064]5.1)取上述超濾液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸鈉溶液18.8L，在不斷攪拌下緩緩加入lmol/L醋酸鈣溶液11.28L ；
[0065]5.2)用2mol/L NaOH調節pH值至9.0，穩定后繼續攪拌1.5小時，結束后，離心20分鐘，棄去沉淀物，得濾液180L ；
[0066]6)透析工序
[0067]取上述濾液，透析液扎包(IOOmL/包)，將透析袋放入4°C純化水中，進行透析交換5天,每24小時換 一次純化水；
[0068]7)親和層析
[0069]7.1)用 66L 的含 1.5mol/L (NH4)2SO4 的 0.2mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0070]7.2)將透析液流經此柱，流速控制在3mL/min左右；
[0071]7.3)平衡后，用1.5mol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
[0072]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡緩沖液洗脫，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脫液，_20°C保存；
[0073]8)凍干
[0074]用2mol/L NaOH溶液調節pH值至6.0，裝盤、凍干，得糜蛋白酶9.3kg。
[0075]經檢測，所得糜蛋白酶效價約為1666iu/mg。
[0076]實施例2
[0077]I)多重結晶
[0078]1.1)結晶 I
[0079]將28kg糜蛋白酶原投入反應罐中，加入196L純化水攪拌溶解，加2.5mol/L硫酸500mL攪拌8小時后，再用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5 ;加入飽和硫酸銨溶液56L，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至4.5，置于25°C條件下，恒溫48小時后過濾，收集濾餅
23.2kg ；
[0080]1.2)結晶 II
[0081]將所得濾餅投入反應罐中，加69.6L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.0 ;加23.2L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.0，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅20.2kg ；
[0082]1.3)結晶 III
[0083]將所得濾餅投入反應罐中，加60.6L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.5 ;加20.2L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.5，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅15.1kg，濾液作母液回收；
[0084]1.4)母液回收 III
[0085]量取母液體積81.6L，用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5，加入固體硫酸銨
24.89kg,攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.3kg ；[0086]1.5)結晶 IV
[0087]將所得濾餅投入反應罐中，加52.2L純化水攪拌溶解濾餅，用2.5mol/L硫酸調節pH值至2.5 ;加17.4L飽和硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至5.0，置于25°C條件下，恒溫24小時后過濾，收集濾餅12.6kg，濾液作母液回收；
[0088]1.6)母液回收IV
[0089]量取母液體積70.1L，用2.5mol/L硫酸調節pH值至3.5，加入固體硫酸銨21.38kg,攪拌溶解，靜置過夜，次日過濾，收集濾餅2.2kg ；
[0090]2)活化
[0091]將所得濾餅投入反應罐中，加44.4L純化水溶解，加2.5mol/L硫酸助溶，用5mol/L NaOH調節pH值至7.0 ;加入14.8L磷酸緩沖液，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調節pH值至7.5，得料液60.5L。加入胰蛋白酶晶體12.lg，置于4°C冰箱中，兩天后用5mol/L NaOH調節pH值至8.0，得活化液58.4L ；
[0092]3)鹽析
[0093]上述活化液用2.5mol/L硫酸調節pH值至4.0,加入固體硫酸銨29.2kg，靜置過夜,次日過濾,收集濾餅12.2kg ；
[0094]4)超濾
[0095]將所得濾餅投入反應罐中，加入磷酸鹽緩沖液183L，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調節PH值至8.5，待液體超濾，體積控制在3/10，得超濾液185L ；
[0096]5)熱原處理`
[0097]5.1)取上述超濾液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol/L磷酸鈉溶液18.5L，在不斷攪拌下緩緩加入lmol/L醋酸鈣溶液11.1L ;
[0098]5.2)用2mol/L NaOH調節pH值至9.0，穩定后繼續攪拌1.5小時，結束后，離心20分鐘，棄去沉淀物，得濾液178L ；
[0099]6)透析工序
[0100]取上述濾液，透析液扎包(IOOmL/包)，將透析袋放入4°C純化水中，進行透析交換5天,每24小時換一次純化水；
[0101]7)親和層析
[0102]7.1)用 60L 的含 2mol/L (NH4) 2S04 的 0.15mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0103]7.2)將透析液流經此柱，流速控制在2mL/min左右；
[0104]7.3)平衡后，用lmol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫至蛋白檢測儀顯示至基線；
[0105]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡緩沖液洗脫，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脫液，_20°C保存；
[0106]8)凍干
[0107]用2mol/L NaOH溶液調節pH值至6.5，裝盤、凍干，得糜蛋白酶8.8kg。
[0108]經檢測，所得糜蛋白酶效價約為1734iu/mg。
[0109]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡 單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【權利要求】
1.一種親和層析分段洗脫純化糜蛋白酶的方法，該方法包括:通過改變結晶條件進行多重結晶，結合超濾、透析、親和層析等現代生物分離技術，提高了純化糜蛋白酶的效率，保持糜蛋白酶的效價穩定。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:以糜蛋白酶原為原料，依次經過多重結晶、活化、鹽析、超濾、熱原處理、透析、親和層析、凍干等工序純化得到糜蛋白酶。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述純化工藝包括如下步驟: 1)糜蛋白酶原溶解后，加入飽和硫酸銨溶液，過濾，收集濾餅；溶解濾餅，結晶，母液回收，收集濾餅；改變結晶條件，重復結晶3次； 2)溶解濾餅，加磷酸鹽緩沖液，加入活化劑活化； 3)活化液調節pH值后加入固體硫酸銨進行鹽析，靜置過夜，過濾，收集濾餅； 4)加入磷酸鹽緩沖液攪拌調節pH值，超濾； 5)超濾液加入磷酸鈉溶液和醋酸鈣溶液后，調節pH攪拌，離心，棄沉淀物； 6)取上述濾液置于于透析袋中，透析4~6天； 7)親和層析，用2種洗脫液進行洗脫 ，最終收集含糜蛋白酶活性峰的洗脫液，-20°C保存； 8)調節pH值，裝盤、凍干，得糜蛋白酶。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，為了減少蛋白活性的損失，溶解糜蛋白酶原和透析最好選用冰冷的純化水，4°C效果最佳。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，改變條件多次結晶，尤其是母液回收的工藝優化，提高了純化糜蛋白酶的效率，更好的保持了蛋白的活性。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于多重結晶中還應進行必要的母液回收，并且硫酸銨:母液=305g:1L，活化工序中每IOOmL待活化液中加入胰蛋白酶5mg，鹽析工序中每升活化液中加入500g硫酸銨。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析快膠柱包括:苯基-Sepharose2B FF,苯基 _Sepharose4B FF,苯基 _Sepharose6B FF,苯基-SepharoseCL-2B FF，苯基-Sepharose CL-4B FF，苯基-Sepharose CL-6B FF。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析條件為:平衡液選用含0.5-3mol/L (NH4)2SO4 的 0.01-0.3mol/L, PH3-8 的 NaAc-HAc 緩沖液，流速控制在 I ~5mL/min左右，洗脫液選用0.5-3mol/L的(NH4)2SO4溶液和不含(NH4)2SO4平衡緩沖液。
9.如權利要求1~7所述的方法，其特征在于:親和層析純化所得糜蛋白酶效價高達.1500 ~1800iu/mg。
【文檔編號】C12N9/76GK103740689SQ201310643460
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月30日 優先權日:2013年11月30日
【發明者】劉乃山, 林曉磊, 劉振海, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業有限公司