一種以蔗糖為原料生物轉化生產甘露醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶的重組菌株pET28a-sacA-mdh/BL21及其利用該菌株進行發酵生產甘露醇的方法。該方法包括：（1）在含蔗糖的發酵培養基中對該菌株進行發酵條件優化；（2）利用不同濃度的蔗糖進行批式發酵，考察該菌株產甘露醇的生產水平及對蔗糖的轉化率，確定了最適的底物濃度;（3）利用不同方式進行補料發酵生產甘露醇，可提高生產效率和甘露醇的產量。該方法不僅沒有副產物山梨醇產生，而且生產成本低，周期短，原料來源廣泛，工藝簡單，為甘露醇的工業化制備提供了新的方法。
【專利說明】一種以蔗糖為原料生物轉化生產甘露醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種表達蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶的重組菌株pET28a-sacA-mdh/BL21及其利用該菌株發酵生產甘露醇的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]甘露醇(Mannitol)學名己六醇、木蜜醇，是一種六元糖醇，為山梨醇的同分異構體。分子式為C6H14O6，分子量為182.17。甘露醇為無色、白色針狀或柱狀結晶性粉末，無臭，具有清涼甜味。熔點166°C，密度1.489g/cm3 (20°C )，易溶于水，溶于吡啶、苯胺和熱的乙醇，幾乎不溶于大多數常見的有機溶劑。與其他多元醇不同，甘露醇是唯一的具有不吸濕性的晶體。
[0003]甘露醇被廣泛應用于食品、醫藥、輕工和化工等領域。甘露醇的生產方法主要有天然提取法和化學催化法。自然界中還發現很多微生物菌株可以合成甘露醇，已報道的微生物類型有霉菌、酵母菌和細菌，具有甘露醇產率高且不產生山梨醇。對發酵法生產甘露醇的研究較多，從目前的研究來看，乳酸菌是最具有潛力的甘露醇生產菌，它能發酵產生高含量的甘露醇，尤其是異型乳酸菌的甘露醇脫氫酶更易于轉化果糖生成甘露醇，但果糖作為底物相對昂貴，蔗糖相對便宜，能夠利用蔗糖產生甘露醇，更具有生產前景。
[0004]蔗糖水解酶[EC3.2.1.26 (Sucrase)]能可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，由于果糖的甜度高，約為蔗糖甜度的1.36-1.60倍，在工業上具有較高的經濟價值，因此人們對鹿糖水解酶的研究 越來越多。甘露醇脫氫酶(mannitol dehydrogenase)是異型發酵乳酸細菌中合成甘露醇的唯一酶，一種依賴于NADH (EC1.1.1.67)，另一種依賴于NADH(EC1.1.1.138)，催化果糖與甘露醇的相互轉化。在發酵中，蔗糖在蔗糖水解酶作用下生成等量的葡萄糖和果糖，葡萄糖用于能量代謝，而果糖可以在代謝中更多的轉化為甘露醇，從而提高了甘露醇的轉化率。且利用大腸桿菌發酵生產甘露醇，具有發酵周期短、穩定性高等優點。
[0005]2010年，金紅星等人以蔗糖為原料明串珠菌發酵生產甘露醇，但是甘露醇產量僅有7.Slg/LoKorakli, Niklas von Weymarn等人分離或篩選出可高產甘露醇的乳酸菌,采用的碳源多為果糖-葡萄糖混合物或糖蜜-果糖漿混合液，產量較高，但均含有果糖的參與，且發酵周期較長，導致生產成本較高，不利于工業化生產。2009年，王芳等人將甘露醇脫氫酶在大腸桿菌中克隆及表達，以果糖為底物，果糖既用于能量代謝又用于甘露醇的轉化，轉化率為26.67%，轉化率較低。最近，Badal C.Saha等通過實驗，開發出一種成本更低的培養基用于培養Lactobacillus intermedius NRRLB-3693生產甘露醇，以糖蜜和果葡糖衆混合液為碳源發酵生產甘露醇。因此，尋找廉價的底物進行生物轉化生產甘露醇，是當今面臨的主要問題。蔗糖是質優價廉的原料，分解后主要產生果糖基，對于那些經由果糖轉化得到目的產物的生產工藝來說是優選的底物。因此，有效利用蔗糖中的聚合果糖和大腸桿菌的細胞工廠生物轉化生產甘露醇，無疑是比較可行的路線之一。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一株利用蔗糖生長并產甘露醇的重組菌菌株。構建得到的菌株發酵方法可行，易于控制，能將蔗糖中的聚合果糖有效地轉化為甘露醇。并且利用該重組菌株進行發酵，甘露醇產量和產率高，縮短了發酵周期。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種利用上述大腸桿菌重組菌株生產甘露醇的方法。
[0008]利用本發明所述的大腸桿菌pET28a-sacA_mdh/BL21發酵生產甘露醇的方法,具體步驟為:
[0009]從LB板上挑取重組大腸桿菌pET28a-SacA-mdh/BL21單菌落接種于LB液體培養基中，37°C培養過夜，然后按1%_2%的接種量接種于IOOmL LB培養基中，37°C培養，OD600達到0.5-0.8時，添加誘導劑IPTG0.05-0.2mmol/L后至少一次添加底物蔗糖，于22_25°C發酵培養8-12h，底物蔗糖的總量控制在110-180g/L。
[0010]優選的按照如下幾種方法進行發酵培養:
[0011]先加入70-80g/L的底物蔗糖，22-25°C誘導培養5h后再添加35_45g/L蔗糖，培養5h。
[0012]先加入35-45g/L的底物蔗糖22_25°C誘導培養3h后再添加35_45g/L的蔗糖，培養4h后補加35-45%的蔗糖，繼續培養3h。
[0013]發酵過程中控制pH=5.5-7.0，轉速200r/min。
[0014]從LB板上挑取重組大腸桿菌pET28a-SacA-mdh/BL21單菌落接種于LB液體培養基中，37°C培養過夜，然后按`1.5%的接種量接種于IOOmL LB培養基中，37°C培養，OD600達到
0.7時，添加誘導劑IPTG0.lmmol/L和不同方式添加底物蔗糖，蔗糖總濃度均為120g/L。培養溫度23°C，pH=6.0，轉速200r/min。高效液相測定結果。
[0015]發酵結束時甘露醇的含量達到45.19g/L，轉化率為37.66%。
[0016]大腸桿菌重組菌pET28a-sacA_mdh/BL21,由以下方法制得，將來源于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的鹿糖水解酶基因(sacA)全序列和布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri中甘露醇脫氫酶基因(mdh)全序列酶切片段連接到載體pET28a(+ )上生成共表達質粒pET28a-sacA_mdh，轉化到宿主細胞大腸桿菌E.coli DH5 a感受態細胞中，將重組質粒pET28a-sacA-mdh轉化入表達宿主菌E.coli BL21中獲得。
[0017]有益效果:
[0018]I)傳統的甘露醇生產方法，依賴于以葡萄糖出發的化學催化，或以果糖出發的生物轉化。隨著對產物純度和工業流程潔凈無污染要求的提高，生物轉化法生產甘露醇逐漸顯現出優勢。然而，對工業化應用來說，廉價的初級物質原料是降低發酵成本的有效途徑之一。在微生物生產甘露醇過程中，用葡萄糖作為輔助因子的能源，加入的果糖被嚴格的轉化成甘露醇，因此，果糖成為乳酸菌發酵生產甘露醇的必需品，但是果糖價格較貴，而蔗糖相對便宜，蔗糖替代果糖進行發酵生產，無需添加其他碳源，其轉化的果糖可被大腸桿菌重組菌株直接利用，通過其甘露醇脫氫酶轉化為甘露醇。因此，以蔗糖為底物生產甘露醇更有經濟效益，大大降低了生物轉化法生產甘露醇的成本，有望實現工業化生產。
[0019]以往的發酵法生產過程中，大家更多的集中在研究利用乳酸菌來發酵生產甘露醇，很少認為大腸桿菌也可生產甘露醇，更鮮有人想到采用蔗糖為底物生產甘露醇，本發明突破了常規思路，采用以往很少用到的大腸桿菌利用蔗糖為底物生產甘露醇，且轉化率和產量有較大提高。
[0020] 2)該方法不僅沒有副產物山梨醇產生，而且生產成本低，原料來源廣泛，工藝簡單，技術路線成熟。此外，乳酸菌所用的培養基成分較復雜，成本較貴，而大腸桿菌所用的培養基成分簡單、便宜易得，適合于工業化生產。利用乳酸菌發酵生產甘露醇發酵周期需要60小時，而大腸桿菌發酵周期僅為12小時，大大地縮短了發酵周期。乳酸菌高密度培養過程中產生大量的乙酸和乳酸副產物，酸的產生明顯減緩菌體的生長速度，而采用本發明構建的大腸桿菌容易實現細胞的高密度培養。
[0021]因此，利用大腸桿菌作為蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶表達的生物反應器為工業化大規模、低成本發酵生產甘露醇奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0022]圖1大腸桿菌重組菌株利用不同濃度蔗糖轉化生產甘露醇的產量及殘糖量(總糖濃度范圍為30-180g/L)
[0023]圖2大腸桿菌重組菌株利用不同濃度蔗糖轉化生產甘露醇相對總糖的轉化率
[0024]圖3不同補料方式發酵生產甘露醇的產量及殘糖量(總糖濃度約為120g/L)
[0025]圖4不同補料方式發酵生產甘露醇相對總糖的轉化率
[0026]圖5原核表達載體pET28a-sacA_mdh的構建示意圖
【具體實施方式】
[0027]以下結合【具體實施方式】，對本發明作進一步說明。應指出，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。
[0028]實施例1重組大腸桿菌誘導表達蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶
[0029]從LB板上挑取重組大腸桿菌pET28a-SacA-mdh/BL21單菌落接種于LB液體培養基中，37°C培養過夜，然后按1%_2%的接種量接種于IOOmL LB培養基中，37°C培養，0D600達到0.5-0.8時，添加誘導劑IPTG (0.05-0.2mmol/L)，誘導時間為6_10h。
[0030]實施例2
[0031]粗酶液的制備:取誘導表達后的菌液于6000r/min,4°C離心IOmin,棄上清。沉淀用乙酸鈉緩沖液(PH5.3)洗滌兩次，洗滌后的沉淀重懸于裂解緩沖液中，于冰上55Hz超聲破碎，超聲時間3s,間隔4s ;共超聲30min。經超聲處理后的菌液于6000r/min,4°C離心IOmin0取上清液即為粗酶液，測定蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶酶活。
[0032]蔗糖水解酶酶活測定方法:以蔗糖為底物，酶反應總體積為3.0mL，其中包含
2.7mL, pH值5.0，0.2mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，270 u L5%蔗糖，30 u L粗酶液。在42°C恒溫水浴中保溫30min，然后用DNS法測定形成的還原糖量，蔗糖水解酶酶活可達25.78U/mL。
[0033]甘露醇脫氫酶酶活測定方法:取兩只配對的比色皿，一只加入3.0mL乙酸鈉緩沖液作為空白對照，另一只比色皿中依次加入2625 ii L乙酸鈉緩沖液、45 ii LP -NADH和300 u L果糖，混合均勻，30°C放置2min，檢測原始NADH吸光值，待讀數穩定后，馬上加入30 ii L酶液，從加入酶液開始計時，每30s測定一次吸光值，反應結束后得到」A34tolAiin值，根據公式計算酶活力。酶活的定義為:在301:、?冊.3時，每分鐘將1.01111101果糖轉化成甘露醇所用的酶量為I個酶活力單位。經測定甘露醇脫氫酶酶活可達14.56U/mL。
[0034]實施例3重組大腸桿菌以蔗糖為底物批式發酵生產甘露醇
[0035]從LB板上挑取重組大腸桿菌pET28a-SacA-mdh/BL21單菌落接種于LB液體培養基中，37°C培養過夜，然后按2%的接種量接種于IOOmL LB培養基中，37°C培養，OD600達到0.8時，添加誘導劑IPTG0.2mmol/L和不同濃度30_120g/L的底物蔗糖，培養溫度23°C，pH=6,轉速200r/min,發酵時間為10h。取誘導表達后的菌液于6000r/min, 4°C離心IOmin,取上清液，用高效液相色譜法(HPLC)測定甘露醇的產量及糖的殘余量。
[0036]高效液相色譜分析條件:色譜柱為TSK-GEL Amide-80,柱溫維持在80°C，流動相為乙腈:水=90:10,以lmL/min的流速進行洗脫。使用示差折光檢測器進行分析，通過對比保留時間進行定性和定量分析。
[0037]高效液相測定后，重組菌株發酵后，綜合甘露醇產量及轉化率考慮，選擇蔗糖濃度為120g/L時最佳，甘露醇含量為42.66g/L，轉化率為35.55%。
[0038]實施例4重組大腸桿菌以蔗糖為底物補料發酵生產甘露醇
[0039]從LB板上挑取重組大腸桿菌pET28a-SacA-mdh/BL21單菌落接種于LB液體培養基中，37°C培養過夜，然后按1.5%的接種量接種于IOOmL LB培養基中，37°C培養，OD600達到0.7時，添加誘導劑IPTG(0.lmmol/L)和不同方式添加底物蔗糖，蔗糖總濃度均為120g/L。培養溫度37°C，pH=6.0，轉速200r/min。方法A:加入120g/L的底物蔗糖和誘導劑IPTG，23°C發酵培養10h，取樣檢測；方法B:先加入80g/L的底物蔗糖和誘導劑IPTG，23°C誘導培養5h后再添加40g/L的鹿糖,培養5h,取樣檢測。方法C:先加入60g/L的底物鹿糖和誘導劑IPTG，25°C誘導培養5h后再添加60g/L的蔗糖，培養5h，取樣檢測。方法D:先加入40g/L的底物蔗糖和IPTG，20°C誘導培養3h后再添加40g/L的蔗糖，培養4h后補加40g/L的蔗糖，繼續培養3h，取樣檢測。高效液相測`定結果如下表1:
[0040]表1不同補料方式對甘露醇產量的影響
[0041]
【權利要求】
1.一株表達蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶的重組大腸桿菌，該菌株可表達來源于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的鹿糖水解酶基因sacA和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)的甘露醇脫氫酶基因mdh。
2.根據權利要求1所述表達蔗糖水解酶和甘露醇脫氫酶的重組大腸桿菌，由以下方法制得，將Lactobacillus plantarum中鹿糖水解酶基因和Lactobacillus buchneri中甘露醇脫氫酶基因序列酶切片段連接到載體pET28a上生成共表達質粒pET28a-SacA-mdh，轉化到宿主細胞大腸桿菌E.coli DH5a感受態細胞中，將重組質粒pET28a-sacA-mdh轉化入表達宿主菌E.coli BL21中獲得。
3.一種利用權利要求1所述的重組大腸桿菌以蔗糖為底物發酵生產甘露醇的方法，步驟為:重組大腸桿菌pET28a-sacA-mdh/BL2137°C培養，0D600達到0.5-0.8時，添加誘導劑IPTG (0.05-0.2mmol/L)后至少一次添加底物蔗糖，于22_25°C發酵培養8_12h，底物蔗糖的總量控制在110-180g/L。
4.根據權利要求3所述重組大腸桿菌以蔗糖為底物發酵生產甘露醇的方法，其特征在于，先加入70-80g/L的底物蔗糖，22-25°C誘導培養5h后再添加35_45g/L蔗糖，培養5h。
5.根據權利要求3所述重組大腸桿菌以蔗糖為底物發酵生產甘露醇的方法，其特征在于，先加入35-45g/L的底物蔗糖22-25°C誘導培養3h，后再添加35_45g/L的蔗糖，培養4h后補加35-45g/L的鹿糖,繼續培養3h。
6.根據權利要求3-5任一所述重組大腸桿菌以蔗糖為底物發酵生產甘露醇的方法，其特征在于，添加誘導劑IPTG0.05-0.2mmol/L。
7.根據權利要求3所述重組大腸桿菌以蔗糖為底物發酵生產甘露醇的方法，其特征在于，發酵過程中控制pH=5.5-7.0，轉速2`00r/min。
【文檔編號】C12N1/21GK103642745SQ201310643082
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】李玉, 路福平, 陳艷, 王正祥, 田康明 申請人:天津科技大學