枯草芽孢桿菌Pc3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用的制作方法
【專利摘要】枯草芽孢桿菌Pc3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用，涉及芽孢桿菌。所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3的保藏編號為CCTCC?NO：M2013470。枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用，防治的植物致病真菌包括：香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌和鐮刀菌等。在油菜菌核病菌防治的盆栽試驗中有較好的生物防治效果，防效可以達到95.6%。枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）Pc3發酵上清液的制備工藝簡單，抑真菌譜廣，生防效果好。
【專利說明】枯草芽孢桿菌Pc3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及芽孢桿菌，尤其是涉及一種枯草芽孢桿菌PC3及其在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著植物病蟲害對已有農藥的耐藥性及新病害的出現，要求不斷開發新的農藥。微生物資源一直是農業工作者研究的重點資源，尋找新的微生物源先導化合物或活性產物是農藥創制的主要手段之一。但是由于研究開發時間長，對篩選技術要求較高，篩選得到新型農用活性物質越來越困難。從新藥研發的進程來看，絕大部分還是來自于自然資源(Bevan et al.1995)，其中包括微生物和植物提取物的活性篩選(Shadomy.1987)。
[0003]隨著陸地微生物資源的日漸枯竭，從陸源微生物中發現新結構活性物質的幾率越來越小。新的微生物類群在微生物代謝產物研究領域越來越受到人們的重視，而且也是篩選新的微生物代謝產物的一條重要途徑。近年對海洋和極地微生物資源的研究結果充分證明，利用海洋和極地微生物資源研制開發新型藥物具有著巨大的潛力和誘人的前景(Zhanget al.2005)。
[0004]南極由于其獨有的地理及氣候特征，是一個潛在的、有待開發的微生物資源庫。它不僅是獨特生態系統微生物的生存繁衍地，而且是新型生物活性物質(如酶、多糖及脂類等)和先導化合物合成菌株的潛在種源地。在這種特殊的生態多樣性環境中生存的微生物，可能具有不同于陸生微生物的獨特的遺傳和代謝多樣性。因此，南極微生物資源可能是新型化合物或新型活性代謝產物的潛在來源。
·[0005]芽孢桿菌是一類好氧、能產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌。這類菌能產生脂肽抗生素、細胞壁降解酶類、細菌素、抗菌蛋白及揮發性抗菌物質，對某些植物病原真菌或細菌、甚至某些動物病原菌、病毒等表現出一定的抑制作用((Stein2005)。同時，這類細菌可以通過發酵大規模獲得，且產生的芽孢對高溫、強酸、紫外線具有很強的耐受力。因此，有關芽孢桿菌的研究已成為近幾年國內外的研究熱點之一。已報道的能抑制真菌生長的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuriniensis)、臘狀芽孢桿菌(B.cereus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、解淀粉芽孢桿菌(B.amy11quefaci)等。
【發明內容】
[0006]本發明的目的之一在于提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3。
[0007]本發明的目的之二在于提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用。
[0008]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Pc3分離自中國第28次南極科學考查所采集的海水樣品(D3-3站點；W50.76°，N61.16° );該菌已于2013年10月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，中國典型培養物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學，郵編為430072，保藏中心保藏編號為CCTCC NO:M2013470。
[0009]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3分離自中國第28次南極科學考查所采集的海水樣品，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增其16S rDNA序列，與美國國家生物技術信息中心(NCBI)GenBank數據庫中相應的序列進行比對分析，發現其與芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)具有99%的序列相似性；16S rDNA序列的GenBank登錄號為KF751703。 [0010]為實現植物致病真菌防治的目的，首先將該菌在含有5mlLB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到IL發酵培養基中進行培養,發酵結束后離心除去菌體，得到發酵上清液，該發酵上清液直接噴灑植物用于致病真菌的防治。
[0011]所述LB 培養基的組成如下(g/L):葡萄糖 20，KH2P046, K2HPO4H, MgSO40.2，(NH4)2S044，2ml 微量元素(FeSO4.4H20, CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2 各 ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用)，0.1MPa滅菌30min。
[0012]所述離心除去菌體是指在6000~8000g下離心lOmin。
[0013]所述菌株活化培養時間為8~12h，發酵培養時間為36~72h ;所述菌株培養過程中的pH為5.0~8.0 ;所述細菌培養發酵的溫度為28~37°C。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Pc3抑制的植物致病真菌種類包括以下真菌:香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌和鐮刀菌等。在油菜菌核病菌(核盤菌)防治的盆栽試驗中有較好的生物防治效果，防效可以達到95.6%。
[0014]與現有技術相比，本發明具有以下優點:芽孢桿菌Pc3發酵上清液的制備工藝簡單，抑真菌譜廣，生防效果好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3的菌落形態。
[0016]圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3的發酵上清液對不同植物致病真菌的抑菌效果圖。在圖2中:A，長柄鏈格孢B，綠色木霉C，香蕉炭疽菌D，核盤菌E，立枯絲核菌F，鐮刀菌G，宛氏擬青霉。
[0017]圖3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3的發酵上清液防治油菜菌核病的盆栽試驗生防效果。在圖3中，Pc3:Pc3發酵上清液處理過油菜植株；CK:發酵培養基處理過油菜植株(作為陰性對照)。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明作進一步描述。
[0019]實施例1:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3的分離篩選
[0020]本發明涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Pc3來源于本 申請人:從中國第28次南極科學考查所采集的海水樣品中所分離獲得，該菌在LB培養基上生長，30°C培養48h后，菌體呈淺黃色，菌落較大，生長初期菌落呈水滴狀，見圖1。
[0021]實施例2:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3菌種鑒定
[0022]利用16S rDNA 通用引物 27F 和 1495R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT ；1495R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT)對南極來源菌株Pc316S rDNA序列進行擴增。以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Pc3 總 DNA 為 PCR 擴增模板，在 Eppendorf PCR 擴增儀上進行 PCR 反應。反應條件為:94°C變性Imin ;55°C退火Imin ;72°C延長1.5min，30個循環。擴增基因送測序公司測序，獲得該菌株16S rDNA序列后，將該序列通過NCBI BLAST與GeneBank中核酸數據進行對比分析(http://ncb1.nlm.nih.gov/blast)。結果發現，Pc316S rDNA序列與Bacillus subtilis (EU257448.l)、Bacillus amyloliquefaciens(KF181458.l)、Bacillusamyloliquefaciens (HG328254.l)、Bacillus subtilis (KC196261.1)等菌株的序列相似性為99%，即枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Pc3與芽孢桿菌同源，因此，將其命名為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) Pc3。
[0023]實施例3:植物致病真菌抗菌譜的測定
[0024]采用濾紙片法測定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3對7種植物致病真菌的抑制活性。用直徑為6mm無菌打孔器將受試致病真菌制成菌塊，用牙簽挑取一菌塊于馬鈴薯固體培養基(PDA)平板中央，28°C的條件下培養1~2天，等待受試致病真菌菌絲體擴散生長后，在每個菌塊的四周放置若干滅菌的直徑6mm的雙層濾紙片，濾紙片距離菌塊中心0.5~1cm，再在每個濾紙片上加50 μ L的無菌發酵上清液，繼續培養2~3天，通過與對照培養的比較，觀測菌絲體的生長是否會受到抑制，如果受試致病真菌的菌絲體受到抑制時，菌絲體會形成月牙型或者線型邊緣。結果如圖2所示，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Pc3發酵上清液對香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、鐮刀菌等7種受試植物致病真菌具有抑制活性。
[0025]實施例4:油菜菌核病(核盤菌感染引起)的生物防治盆栽試驗
[0026]所選油菜品種為秦優10號，施藥時期為油菜盛花后期，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Pc3發酵上清液使用小型噴霧器(500ml)進行均勻噴霧，孔徑<7mm，藥劑不留殘液，然后在油菜葉片和莖桿(接種前用接種針制造微傷口)上接種菌碟(選取I株油菜菌核病菌，活化2天后制成直徑5mm的菌碟)，接種后的盆鉬置于25°C，相對濕度80%的環境下，3天后調查病斑直徑(d)，計算病斑面積(病斑面積=π * (d/2)2)，通過以下公式計算防效:
[0027]
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Pc3,已于2013年10月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO:M2013470。
2.如權利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Pc3在制備防治植物致病真菌發酵上清液中的應用。
3.如權利要求2所述應用，其特征在于所述防治植物致病真菌發酵上清液的制備方法如下:首先將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Pc3在含有5ml LB培養基的試管中進行活化培養，然后將活化的菌株接種到IL發酵培養基中進行培養,發酵結束后離心除去菌體，得到防治植物致病真菌發酵上清液。
4.如權利要求3所述應用，其特征在于所述LB培養基的組成如下:葡萄糖20g/L，KH2P046g/L，K2HP0414g/L，MgSO40.2g/L，(NH4) 2S044g/L，2ml 微量元素，0.1MPa 滅菌 30min,所述微量元素包括FeSO4.4H20, CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用。
5.如權利要求3所述應用，其特征在于所述離心除去菌體是在6000~8000g下離心10min。
6.如權利要求3所述應用，其特征在于所述菌株活化培養時間為8~12h，發酵培養時間為36~72h ;所述菌株培養過程中的pH為5.0~8.0。
7.如權利要求3 所述應用，其特征在于所述細菌培養發酵的溫度為28~37°C。
8.如權利要求3所述應用，其特征在于所述植物致病真菌包括:香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌和鐮刀菌。
【文檔編號】C12N1/20GK103589674SQ201310637219
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】陳新華, 郭文斌, 崔鵬飛 申請人:國家海洋局第三海洋研究所