一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法
【專利摘要】本發明涉及一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法，步驟如下：（1）堿提：將米糠高溫粕按照料液質量比1:10～12加水攪拌均勻，調節pH至11～11.5，于50℃堿提2h，離心得上清液，上清液pH值調至4.6，靜置1h，再次離心獲得米糠蛋白；（2）一次酶解：米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，調節pH至6.8～7.0，加熱至50℃至米糠蛋白全部溶解，加入適量風味蛋白酶于50～55℃酶解2.5～3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8～7.0，滅酶離心獲得一次酶解上清液；（3）二次酶解：一次酶解上清液調pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50～60℃酶解2.5～3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性，滅酶離心獲得二次酶解上清液；（4）濃縮和干燥。該方法制備的米糠多肽氨基酸種類豐富，提取率高，雜質含量低，溶解度高。
【專利說明】一種從米糠高溫粕中制備米糠多肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備多肽的方法，具體的說是涉及一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法。
【背景技術】
[0002]米糠高溫柏是米糠經過高溫提油后的產物，因受高溫影響，其可溶性蛋白的含量減少，導致了其提取率的減小，且提取的蛋白中雜質較多，即蛋白含量不高，另外，提取的蛋白溶解度不高，而蛋白質的溶解度影響其能否在食品中得到廣泛應用的重要因素之一。為充分利用米糠高溫柏資源，進一步提高米糠蛋白溶解性，強化其功能特性，拓寬其在食品中的應用，宜利用米糠高溫柏制備米糠多肽。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于解決現有技術從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法提取率低，且提取的多肽雜質多及溶解度不高的不足，提供一種新的從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法。該方法利用風味蛋白酶和堿性蛋白酶分步水解，制備氨基酸種類豐富和營養全面的米糠多肽，提取率高，獲 得的米糠多肽中雜質含量低，溶解度高，能廣泛應用于食品領域中。
[0004]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0005]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0006](I)堿提:將米糠高溫柏按照料液質量比1:10~12加水攪拌均勻，調節pH至11~11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，所述上清液pH值調至4.6，靜置lh，再次離心，去除上清液獲得米糖蛋白；
[0007](2 )一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，調節pH至6.8~
7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入適量風味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8~7.0，酶解結束后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液；
[0008](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性,酶解完成后滅酶,然后離心去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0009](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液進行脫鹽處理后，然后經過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0010]作為優選，步驟(2)中米糠蛋白(以干基計)與水的質量比為:1:2，風味蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質量的0.5%，風味蛋白酶的活性為20000U/g。
[0011]作為優選，步驟(3) 二次酶解中堿性蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質量的0.28%，堿性蛋白酶的活性為20萬U/g。
[0012]更優選，步驟(3)中二次酶解的溫度為54°C，pH為9.4，酶解時間為3.0h。pH對酶反應的影響，主要表現對在酶活力的影響，過酸或過堿都會影響其活性，發明人經過試驗研究發現當二次酶解的PH值從8到9.5時，酶解效率漸高，再增大pH值，其酶解效率反而降低，這表面堿性蛋白酶顯著的酶活性只發生在非常窄的PH值范圍內，堿性蛋白酶和底物的蛋白質都含有解離基團，只有這些解離基團處于特定的解離狀態時，堿性蛋白酶與底物蛋白才結合最快，生成產物的速度最快，體系的PH值直接影響著酶和底物蛋白質分子的某些解離基團的解離狀態，只有在特定的PH值條件下，酶和底物蛋白質的解離基團才處于結合和轉化為產物的最佳解離狀態，本發明確定的最佳二次酶解pH值為9.4，此時堿性蛋白酶對米糠蛋白底物的酶解效率最高。
[0013]作為優選，步驟(2) —次酶解中滅酶溫度為90°C，時間為lOmin，離心的轉速為4000~4500rpm,離心時間為20~25min。
[0014]作為優選，步驟(3) 二次酶解中滅酶溫度為85，°C時間為lOmin，離心的轉速為4000~4500rpm,離心時間為10~15min。
[0015]本發明的有益效果是:
[0016]( I)本發明先通過堿溶酸沉獲得米糠蛋白，然后進一步通過雙酶法酶解米糠蛋白制備米糠多肽，工藝設計合理，反應條件溫和，具有酶解效率高，米糠多肽產率高、生產成本低的優點，易于實現產業化。
[0017](2)本發明利用雙酶法制備的米糠多肽氨基酸種類豐富，含有17種氨基酸，除去色氨酸(檢測時被破壞)，還含有另外7中必需氨基酸，且其第一限制性氨基酸賴氨酸含量很好，占總氨基酸含量的7.2%， 蛋氨酸和半胱氨酸含量也占氨基酸總量的6.7%，營養價值十分豐富。
[0018](3)本發明利用雙酶法制備的米糠多肽的分子量主要集中在180Da~500Da之間，占全部米糠多肽的50.38%左右；分子量500Da~1000Da之間的多肽占全部米糠多肽的21.25%左右，米糠多肽的分子量小，吸收利用率高，進一步強化了米糠多肽的營養價值。
【具體實施方式】
[0019]下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明，各實施例使用的儀器設備均系市購常規設備，各實施例所使用的試劑均系市購常規試劑。
[0020]堿性蛋白酶酶活:20萬U/g ;風味蛋白酶酶活:20000U/g。
[0021]米糠多肽分子量測定方法:采用Waters600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器、Empower工作站和GPC軟件)，對制備的米糠多肽的分子量分布進行測定:色譜柱選用TSKgel2000SWXL300mmX7.8_，流動相:乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1 (V/V)，檢測波長:220nm，流速:0.5mL/min ;柱溫:30°C，進樣體積:10μ I。以細胞色素C (Mwl2500);桿菌酶(Mwl450);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw451);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mwl89)為分子量參照物。
[0022]( I)分子量標準曲線的繪制
[0023]以上述4個標準蛋白質分子質量的對數為縱坐標，保留時間為橫坐標的IgMw遷移率圖，即分子量標準曲線，并建立線性回歸方程。
[0024](2)米糠多肽分子量分布測定
[0025]采用HPLC測定其分子量分布，測定條件及樣品制備同上。測定出的分子質量分布圖結合分子量標準曲線用GPC軟件進行分析，以不同分子量范圍內的峰面積百分比為該分子量分布范圍內多肽所占的百分比。
[0026]米糠多肽氨基酸含量測定:中國農業科研院油料作物研究所測試中心。
[0027]實施例1~3所使用的原料:米糠高溫柏的蛋白質含量79.56%，水分含量7.55%，灰分含量1.79%ο
[0028]實施例1:
[0029]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0030](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質量比1:10加水攪拌均勻，調節pH至11，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉速為4000rpm，離心時間為25min，所述上清液pH值調至4.6,靜置Ih,再次以4000rpm的轉速離心25min,去除上清液獲得米糠蛋白；
[0031 ] (2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，使得米糠蛋白的質量分數為33.3%，調節pH至6.8，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質量
.0.5%的風味蛋白酶于50°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8，酶解結束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉速為4000rpm，離心時間為25min ；
[0032](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調pH值至9.0，加入米糠蛋白質量
0.2%的堿性蛋白酶于50°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值9.0,酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉速為4000rpm條件下離心IOmin去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0033](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進行脫鹽處理后，然后經過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0034]實施例2:
[0035]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0036](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質量比1:12加水攪拌均勻，調節pH至11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉速為4500rpm，離心時間為20min，所述上清液pH值調至4.65，靜置lh，再次以4500rpm的轉速離心20min，去除上清液獲得米糠蛋白；
[0037](2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，使得米糠蛋白的質量分數為33.3%，調節pH至7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質量
0.5%的風味蛋白酶于55°C酶解2.5h，酶解過程中維持酶解液pH值7.0，酶解結束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉速為4500rpm，離心時間為20min ；
[0038](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調pH值至10.0，加入米糠蛋白質量0.3%的堿性蛋白酶于60°C酶解2.5h，酶解過程中維持酶解液pH值10.0,酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉速為4500rpm條件下離心15min去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0039](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進行脫鹽處理后，然后經過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0040]實施例3:
[0041]一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，所述制備方法包括下列步驟:
[0042](1)堿提:將米糠高溫柏按照料液質量比1:11加水攪拌均勻，調節pH至11.2，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，離心的轉速為4200rpm，離心時間為22min，所述上清液pH值調至4.62，靜置lh，再次以4200rpm的轉速離心21min，去除上清液獲得米糠蛋白；
[0043](2) 一次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，使得米糠蛋白的質量分數為33.3%，調節pH至6.9，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入米糠蛋白質量
0.5%的風味蛋白酶于52°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.9，酶解結束后于90°C滅酶lOmin，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液，離心的轉速為4200rpm，離心時間為25min ；
[0044](3) 二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調pH值至9.4，加入米糠蛋白質量
0.28%的堿性蛋白酶于54°C酶解3h，酶解過程中維持酶解液pH值9.4，酶解完成后于85°C滅酶lOmin，然后在轉速為4300rpm條件下離心12min去除沉淀，獲得二次酶解上清液；
[0045](4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液過陰陽離子交換樹脂進行脫鹽處理后，然后經過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
[0046]實施例1~3制得的米糠多肽的分子量分布見表1。
[0047]表1米糠多肽的分子量分布
[0048]
【權利要求】
1.一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟: (O堿提:將米糠高溫柏按照料液質量比1:10~12加水攪拌均勻，調節pH至11~11.5，于50°C堿提2h，然后離心得上清液，所述上清液pH值調至4.6，靜置lh，再次離心，去除上清液獲得米糖蛋白； (2)—次酶解:將步驟(1)獲得的米糠蛋白加入適量水攪拌均勻，調節pH至6.8~7.0，加熱至50°C至米糠蛋白全部溶解，加入適量風味蛋白酶于50~55°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值6.8~7.0，酶解結束后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得一次酶解上清液； (3)二次酶解:將步驟(2)的一次酶解上清液調pH值至堿性，加入堿性蛋白酶于50~60°C酶解2.5~3h，酶解過程中維持酶解液pH值呈堿性，酶解完成后滅酶，然后離心去除沉淀，獲得二次酶解上清液； (4)濃縮和干燥:將步驟(3)獲得的二次酶解上清液進行脫鹽處理后，然后經過真空濃縮后冷凍干燥，得到米糠蛋白多肽。
2.根據權利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(2)中米糖蛋白(以干基計)與水的質量比為:1:2,風味蛋白酶的添加量為米糖蛋白干基質量的0.5%，風味蛋白酶的活性為20000U/g。
3.根據權利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3) 二次酶解中堿性蛋白酶的添加量為米糠蛋白干基質量的0.2~0.3%，堿性蛋白酶的活性為20萬U/g。
4.根據權利要求3所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3)中二次酶解的溫度為54°C，pH為9.4、加酶量為0.28%，酶解時間為3.0h。
5.根據權利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(2) —次酶解中滅酶溫度為90°C，時間為lOmin，離心的轉速為4000~4500rpm，離心時間為20~25min。
6.根據權利要求1所述的一種從米糠高溫柏中制備米糠多肽的方法，其特征在于:步驟(3) 二次酶解中滅酶溫度為85°C，時間為lOmin，離心的轉速為4000~4500rpm，離心時間為10~15min。
【文檔編號】C12P21/06GK103627767SQ201310634437
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】何東平, 姚行權, 胡傳榮, 姚行江, 張世宏, 鄒翀, 尤夢圓, 吳建寶, 劉京偉 申請人:衢州劉家香食品有限公司