血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種應用甘油脫氫酶測定血清中甘油三酯的方法，屬于利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法。本發明的技術方案是：甘油脫氫酶及NAD+同在試劑I中，試劑II含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為：血清先與試劑I于37℃溫浴3～5分鐘，血清中游離甘油與試劑I反應生成NADH，加入試劑II后于37℃溫浴4～7分鐘，甘油三酯水解后生成甘油經反應產生NADH，儀器在340nm波長處檢測，以試劑I反應產生的NADH為空白，由試劑II反應產生的NADH計算出甘油三酯的含量。本發明檢測時不受內源性甘油影響，其使用方法和范圍與其它酶法相同，所用工具酶少，受雜酶干擾少，試劑成本低，經濟方便易行，是一種準確性更高的甘油三酯檢測方法。
【專利說明】血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法。【背景技術】
[0002]血清中甘油三脂(TG)的測定方法一般可分為化學法、酶法和色譜法3大類。早期測定方法是以總脂質與膽固醇和磷脂之差估算。比較準確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干擾、變色酸顯色靈敏度高、顯色穩定，至今還是美國疾病控制與預防中心(CDC)的內部參考方法。但因操作步驟繁多、技術要求高而不適于臨床常規檢測工作中應用。色譜法包括核素稀釋/氣相色譜/質譜等方法(ID/GC/MS)，主要用作參考系統中決定性方法的建立及參考物質的制備與定值，此法費用昂貴，樣品處理復雜，難以推廣應用，應用高效液相色譜儀測定血清中的甘油三酯，檢測成本高，難以在臨床推廣。
[0003]目前國內幾乎所有的臨床實驗室都用酶法檢測血清TG水平，此方法分為一步法和兩步法，雖然方法各異，但一般都包括以下幾個基本反應步驟:用最合適的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，在過氧化物酶(POD)的催化下，H2O2,4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚形成有色染料(常為醌亞胺類)，這些物質的生成量與樣本中的甘油三酯含量成正比。本發明采用甘油脫氫酶為工具酶，是將試劑分成兩部分，僅以脂蛋白脂肪酶為第二試劑，由于試劑組成成分加入順序不同，對甘油三酯測定結果產生不同效果，具有消除游離甘油干擾的特性，本法應用工具酶少，降低雜酶干擾和試劑成本等優點，具體反應步驟如下:
[0004]第一步反應:
[0005]
【權利要求】
1.一種血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法，其特征在于甘油脫氫酶及NAD+同在試劑I中，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為:血清先與試劑I于37°c溫浴3~5分鐘，血清中游離甘油與試劑I的反應生成NADH，加入試劑II后于37°C溫浴4~7分鐘，甘油三酯水解后經反應也生成NADH，儀器在334~340nm波長處檢測，以試劑I反應產生的NADH為空白，由試劑II反應產生的NADH計算出甘油三酯的含量，計算公式為:
ODtg = OD2-OD1X [ (SV+RJi) / (SY+R1Y,+R2Y2)] 甘油三酯濃度=FXODtg 其中ODtc是甘油三酯產生的吸光度，OD1是樣品加入試劑I反應后測得的吸光度，OD2是樣品加入試劑II反應后測得的吸光度，SV是血清的體積，R1V1是試劑I的體積，R2V2是試劑II的體積，F是校正因數。
2.根據權利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法，其特征在于試劑I中含有甘油脫氫酶及NAD+。
3.根據權利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法，其特征在于試劑I中每升碳酸鹽緩沖液溶解碳酸鉀100~300mmol,碳酸氫鈉100~300mmol, NAD+5~15mmol，甘油脫氫酶 40000 ~50000U, Proclin-300 防腐劑 100 μ I ~300 μ I ;試劑 II 中每升碳酸鹽緩沖液溶解碳酸鉀100~300mmol，碳酸氫鈉100~300mmol，溶解脂蛋白脂肪酶1800 ~2100U，Triton X-100 0.08g ~0.16g, Proclin-300 防腐劑 100 μ I ~300 μ I。
4.根據權利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法，其特征在于試劑I和試劑II中碳酸鹽緩沖 液的PH值為10.5~11.5。
5.根據權利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測定方法，其特征在于測定的體積比為:樣品:試劑1:試劑II = I: 70~80: 20~30。
【文檔編號】C12Q1/32GK103602718SQ201310601425
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】李立和, 張超, 白會倉, 丁弘, 郭秋紅 申請人:天津市寶坻區人民醫院