一株產纖維素酶菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株產纖維素酶的菌株，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為：CGMCC?No.8339，類命名為：青霉菌株Penillium?piceum?H16。所述青霉菌株是將在秸稈中篩選得到的菌株Penillium?piceum?9-3為出發菌株經誘變處理后得到的。本發明將Penillium?piceum?9-3做為出發菌株誘變育種，選育得到一株產高活力纖維素酶的青霉菌株Penillium?piceum?H16，所述青霉菌株H16發酵得到的纖維素酶粗酶液，其濾紙酶活力達到7IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活力達到50IU/mL。通過將所述青霉菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纖維素酶系進行不同配比研究，得出在最優配比時大幅度高了酶活以及對微晶纖維素的水解率，降低了用酶成本。
【專利說明】一株產纖維素酶菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明微生物學領域，特別涉及一株產纖維素酶菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]人類進入21世紀以來，在能源、資源、環境等方面面臨著越來越嚴峻的挑戰。纖維素是地球上最大的可再生性有機資源，利用這些廉價的、可再生的植物纖維素原料來生產生物基產品以及生物質能，對人類的可持續發展是非常有利的。纖維素是植物細胞壁的主要成分，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。在我國， 每年有數億噸的農作物秸桿被焚燒掉，既污染了環境又浪費了資源。目前纖維素糖化的方法主要有酸解法和酶解法，但酸解法有耗能大、對設備損耗大、污染大等缺點，因此酶解法將是纖維素酶糖化的主要趨勢。但由于纖維素酶的生產成本過高，導致木質纖維素降解成本過高，使得無法真正實現工業化。因此，為了提高酶水解效率，降低工業生產中纖維素酶的成本，世界各國科學家圍繞纖維素酶展開了廣泛的研究，包括菌株的篩選、發酵工藝的優化等等。
[0003]纖維素酶是使纖維素降解生成葡萄糖的一組酶的總稱，主要包括內切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和3 -葡萄糖苷酶。纖維素酶的三個組分經過協同作用，將大分子的纖維素降解為低分子量的寡糖、雙糖或多糖。纖維素酶廣泛的應用于食品加工業、釀造業、造紙工業、飼料添加劑、紡織工業、醫藥領域、植物細胞融合等方面。
[0004]目前，纖維素酶的生產方法一般是固態發酵和液態發酵。固態發酵成本低，但易污染雜菌，不易提取，難以進行大規模工業化生產。而液態發酵，屬于密閉式發酵，發酵過程中不易污染，且發酵條件以控制，后期分離提取酶液簡便，因此便于大規模生產。生產高活性的纖維素酶除具有優良的發酵工藝路線，包括培養基、發酵時間、發酵溫度等，最關鍵的因素是選育高產菌株。
[0005]纖維素酶的產生菌包括細菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纖維素酶生產的菌種主要為絲狀真菌。絲狀真菌產生的纖維素酶酶系較全，且其產生的酶多為胞外酶，便于后期的分離提取。目前研究較多的菌包括木霉、曲霉等，例如里氏木霉、黑曲霉，尤以木霉屬最為受關注，而對青霉屬的報道較少。本發明所表述的即為一株高產纖維素酶的青霉屬菌株。
【發明內容】
[0006]本發明目的在于提供一株產纖維素酶菌株。本發明是利用誘變方法對出發菌株進行誘變篩選出更高產的纖維素酶菌株，并且所述纖維素酶的酶活力得到了很大提高。本發明對儀器設備要求低，操作簡單，很大程度上降低了用酶成本。
[0007]為實現上述目的，本發明所采取的技術方案為:
[0008]一株產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.8339，分類命名為:青霉菌株Penillium piceum H16。[0009]本發明的青霉菌株Penillium piceum H16的形態學特征為:
[0010]本發明的檜狀青霉H16的形態學特征為:菌株H16在PDA培養基上30°C恒溫培養 2d即可看到清晰的白色菌落，菌落開展，絨狀，4~5d時表層著生一層墨綠色分生孢子粉， 菌株生長后期背面觀察呈黃色。孢子的顏色較出發菌株Penillium piceum 9-3相比要深， 出發菌株為黃綠色，H16的孢子為墨綠色。
[0011]所述青霉菌株H16是將菌株Penillium piceum 9_3經誘變方法處理后篩選得到的。
[0012]所述誘變篩選方法包括以下步驟:
[0013]I)在所述菌株Penillium piceum 9_3的孢子懸液中添加硫酸二乙酯,所述硫酸二乙酯添加量為使所述孢子懸液中硫酸二乙酯的質量百分比濃度為1%，之后在10~ 30°C, 50~150rpm震蕩反應10~120min，獲得所述孢子懸液的誘變處理液，備用；
[0014]2)以所述反應時間為準，每間隔IOmin按體積比為1: 9取出誘變處理液與濃度為25%的硫代硫酸鈉溶液進行混合，獲得誘變終止液并根據時間順序編號；
[0015]3)將編號的所述誘變終止液按順序分別涂布PDA平板，25~33 °C培養直至長出單菌落；
[0016]4)將所述單菌落通過對比在剛果紅平板上透明圈與菌落直徑之比的大小和發酵培養測定粗酶液酶活力的方法篩選得到所述青霉菌株H16。
[0017]所述步驟I)所述反應時間為60min。
[0018]所述青霉菌株H16應用于生產纖維素酶。
[0019]—株應用權利要求1~5所述產纖維素酶菌株產纖維素酶的方法,其特征在于,用于培養所述產纖維素酶菌株的培養基的組分含量為:微晶纖維素10~30g/L，葡萄糖I~ 10g/L,玉米衆干粉10~20g/L,硫酸銨I~10g/L,磷酸二氫鉀I~10g/L,硫酸鎂I~IOg/ L以及加水至1L。
[0020]優選的是，所述培養條件為:溫度為26~32°C，轉速為150~250rpm震蕩培養， 初始PH為5.0~6.0，接種量為I~5%，發酵培養時間為96~144h。
[0021]優選的是，所述培養條件為:初始pH為5.5，發酵培養時間為120h。
[0022]本發明的有益效果是本發明將Penillium piceum 9_3做為出發菌株誘變育種,選育得到一株產高活力纖維素酶的青霉菌株，所述菌株發酵得到的纖維素酶粗酶液，其濾紙酶活力達到7IU/mL，^ -葡萄糖苷酶酶活力達到50IU/mL。通過將所述菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纖維素酶系進行不同配比研究，得出在最優配比時大幅度高了酶活以及對微晶纖維素的水解率，降低了用酶成本。本發明對儀器設備要求低，操作簡單，很大程度上降低了用酶成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明所述產纖維素酶菌株誘變篩選方法流程圖。
[0024]圖2為本發明所述產纖維素酶菌株發酵所得粗酶液與里氏木霉RUT-C30的粗酶液按照不同體積比例配比所得混合酶液的濾紙酶活力比較圖。
[0025]圖3為本發明所述產纖維素酶菌株和里氏木霉RUT-C30的混合酶提取液與里氏木霉酶RUT-C30提取液的水解率的比較圖。【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0027]實施例1:出發菌株的培養
[0028]將檜狀青霉菌株9-3在PDA斜面上連續活化兩次，在30°C恒溫箱中培養3_4天，之后，4 C保存備用。
[0029]檜狀青霉9-3 (Penicillium piceum 9-3) 0保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期:2011年10月9日，保藏號:CGMCC5314。
[0030]實施例2:硫酸二乙酯誘變篩選菌株H16 (如圖1所示)
[0031]I)硫酸二乙酯誘變
[0032]用pH為7的磷酸緩沖液洗下PDA斜面培養的孢子，無菌玻璃珠打散，兩層無菌擦鏡紙過濾，得孢子懸液，血球計數板計數，調整孢子濃度為IO6個/mL，取4mL孢子懸液，加入到16mL的pH為7的磷酸緩沖液中，再添加0.2mL硫酸二乙酯,在30°C, 150r/min條件下反應開始20min后每隔5min取反應液0.1mL加入到0.9mL的濃度為25%的硫代硫酸鈉中充分混合，終止誘變反應，然后將混合液稀釋三個梯度使混合液中菌種終濃度為IO5個/mL、 IO4個/mL、IO3個/mL，分別取三種濃度的稀釋液0.1mL涂布PDA平板，30°C培養直至長出單菌落，用于檢測誘變的致死率和正突變率。如表1所示，55min時致死率)和正突變率 (% )幾乎達到100%。
[0033]2)篩選
[0034]①剛果紅染色篩選:在上述平板上選取不同處理時問、不同形態的菌落100株，接種到含有蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉5g/L，羧甲基纖維素鈉10g/L，磷酸二氫鉀Ig/ L，瓊脂18g/L，吐溫-80 2mL/L。30°C培養4_5天后，用濃度為I %的剛果紅染色lh。在上述平板上選取透明圈與菌落直徑比值較大的菌落9個，接種到PDA斜面，30°C培養4-5天后保存菌種。
[0035]②發酵培養篩選:將上述保存的菌株接種到種子培養基中增值培養，然后接入到發酵培養基進行誘導產酶，并對離心獲得粗酶液進行酶活測定，經過對比篩選得到I株酶活較高的菌株。
[0036]所述的種子培養基為:微晶纖維素20g/L，玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L。
[0037]所述的發酵培養基為:微晶纖維素20g/L，玉米漿干粉17g/L，硫酸銨5g/L，碳酸鈣
2.5g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂lg/L。在30°C，200轉/min，初始pH5.5，接種量3%，發酵培養120h。
[0038]
【權利要求】
1.一株產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.8339，分類命名為:青霉菌株Penillium piceum H16。
2.如權利要求1所述產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H16是將菌株 Penillium piceum 9_3經誘變方法處理后篩選得到的。
3.—株如權利要求2所述的產纖維素酶菌株的誘變篩選方法，其特征在于，向所述菌株Penillium piceum 9-3的孢子懸液中添加硫酸二乙酯進行10~120min誘變反應。
4.如權利要求3所述產纖維素酶的誘變篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)在所述菌株Penilliumpiceum 9_3的所述孢子懸液中添加硫酸二乙酯,所述硫酸二乙酷添加量為使所述抱子懸液中硫Ife二乙酷的質量百分比濃度為0.8~1.2 ,之后在 10~30°C，50~150rpm震蕩反應10~120min，獲得所述孢子懸液的誘變處理液，備用；2)以所述反應時間為準，每間隔8~12min取出0.1~0.3mL誘變處理液與硫代硫酸鈉溶液進行混合中和所述誘變處理液中的硫酸二乙酯以終止誘變反應，獲得誘變終止液并根據時間順序編號；3)將編號的所述誘變終止液按順序分別涂布PDA平板，25~33°C培養直至長出單菌落；4)將所述單菌落通過對比在剛果紅平板上透明圈與菌落直徑之比的大小和發酵培養測定粗酶液酶活力的方法篩選得到所述青霉菌株H16。
5.如權利要求3所述產纖維素酶的菌株的誘變篩選方法，其特征在于，所述步驟I)所述硫酸二乙酯的質量百分比濃度為1%，反應時間為60min。
6.如權利要求2所述產纖維素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H16應用于生產纖維素酶。
7.—株應用權利要求3~5中任一項所述的產纖維素酶菌株產纖維素酶的方法,其特征在于，用于培養所述產纖維素酶菌株的培養基的組分含量為:微晶纖維素10~30g/L，葡萄糖I~10g/L，玉米漿干粉10~20g/L，硫酸銨I~10g/L，磷酸二氫鉀I~10g/L，硫酸鎂I~10g/L以及加水至1L。
8.如權利要求7所述產纖維素酶菌株產纖維素酶的方法，其特征在于，所述培養條件為:溫度為26~32°C，轉速為150~250rpm震蕩培養，初始pH為5.0~6.0，接種量為I~ 5%，發酵培養時間為96~144h。
9.如權利要求8所述產纖維素酶菌株產纖維素酶的方法，其特征在于，所述培養條件為:初始PH為5.5，發酵培養時間為120h。
【文檔編號】C12N15/01GK103555595SQ201310589231
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】陳樹林, 張粲, 宗志友, 賈文娣, 赫榮琳, 武改紅, 李晨, 張東遠 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所