一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法，由軟膠囊體和軟膠囊體內的內容物組成，特點是：按重量百分比稱量蜂膠15%～35%、葛根提取物10%～18%、輔酶Q1010%～15%、積雪草提取物9%～13%、綠茶提取物8%～15%、蜂王漿4%～8%、亞麻籽油5%～15%、紫蘇籽油3%～7%和蜂蠟3%～7%，經過混勻、研磨、脫氣，得內容物；按100∶100∶40比例稱量明膠、水、甘油，升溫化料，脫氣，得膠囊體濾液；將膠囊體濾液和內容物按重量比1∶2～4的比例進行壓丸，再經定型干燥、洗丸、選揀、包裝，即得成品。本發明軟膠囊功效顯著、制備簡單，具有提高免疫力、降血脂、輔助護肝、調節腸道、抗衰老等多功能。
【專利說明】一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以膠囊制劑為特征的醫藥配置品，尤其一種具有提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法。
【背景技術】
[0002]我們知道，人體所有需要的能量幾乎都是ATP(三磷酸腺苷)提供的:心臟的跳動、肌肉的運動以及各類細胞的各種功能都源于ATP所產生的能量。當ATP合成不足缺失時，人體會感覺乏力，并出現心臟功能失調、肌肉酸痛、肢體僵硬、容易疲勞、免疫功能下降等現象；長時間ATP合成不足，身體的組織和器官就會部分或全部喪失其功能。ATP合成不足持續時間越長，對身體各器官的影響就越大，尤其影響最大的組織和器官是心臟和骨骼肌。因此，保證心臟和骨骼肌細胞的ATP及時合成是維護心臟和肌肉功能的重要措施。輔酶QlO是一種體內自行合成的輔酶，存在于人體細胞中，而輔酶QlO又是唯一一種能把我們日常食用的米、面、肉等營養成分轉化成ATP的關鍵物質。人體中輔酶QlO隨著年齡的增長而減少，在人體合成量低于最高值的25%，會造成ATP的合成不足，這樣就造成心臟動力不足。
[0003]采用人工合成的輔酶QlO作為一種強抗氧化劑已經得到應用，用于抑制自由基對免疫細胞上受體與細胞分化和活性相關的微管系統的修飾，增強免疫系統，延緩衰老。目前，輔酶QlO制備的保健組合物或膠囊已有報道，例如2012年10月31日公布的CN102754829A中國發明專利說明書中公開的“一種含輔酶QlO的保健組合物、膠囊制劑及制備方法”，其保健組合物的配料為:2?40份的輔酶Q10、60?98份的乙酯型或甘油三酯型魚油及0.01?10份的輔料；其將輔酶QlO和魚油進行配方組合，能使二者充分發揮各自功效，協同起到抗疲勞作用。2010年12月I日公開的CN 101897440A中國發明專利說明書中公開的“輔酶QlO復合軟膠囊及其制備方法”，其囊內容物由下述原料原料按重量比組成:輔酶QlO:乳酸鋅:亞硒酸鈉:維生素E:玉米油=1: (0.8-1.6): (0.001-0.005):(1.5-3.5): (15-25)。現有公開的含輔酶QlO的軟膠囊均存在著組份少、療效不理想的不足。
【發明內容】
[0004]為了克服現有技術中含輔酶QlO的軟膠囊均存在著組份少、療效不理想的不足，本發明提供一種組份科學、搭配合理、療效好的提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其是由軟膠囊體和封入軟膠囊體內的內容物組成，其特征在于:所述的內容物是由下列組分按重量百分比組成:蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，其組分的重量百分比之和為100% ;所述的軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成；所述的軟膠囊體與所述的內容物的重量比為:1: 2?4。
[0006]所述內容物是由下列重量百分比的組分組成:蜂膠25%、葛根15%、輔酶Q1(l13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6%。
[0007]所述的蜂膠中含總黃酮不低于15% ;所述的葛根提取物中所含有的葛根素不低于4%。
[0008]一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，其特征在于:經過下列工藝步驟:
(a)過篩:將葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊按照比例稱量后，進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，依次置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內容物物料；再將內容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:將明膠、水、甘油按100: 100: 40比例稱料，投送到化膠罐中，攪拌升溫至60?75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa，減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫容器內，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內容物物料按照重量比:1: 2?4的比例送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度22?26°C，濕度為30?40%，靜態干燥24小時后，將膠囊出
丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0009]本發明的軟膠囊具有提高免疫力和保護肝臟器官功能的，其封入軟膠囊體內的內容物選用蜂膠、蜂王漿、蜂蠟、輔酶Q1(l、亞麻籽油、紫蘇籽油進行了合理的配伍，并進一步選取了具有純天然植物葛根、積雪草和綠茶的提取物，各種組分共同作用以達到最佳的提高免疫力效果。其中，
所選取的蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂。近代研究證明，蜂膠具有抗菌、消炎、止癢、抗氧化、增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種功能，能夠分解色素、平復皺紋、減緩衰老、加快組織細胞的再生，還可強化免疫系統，增加抗體產量，顯著增強細胞免疫功能與體液免疫功能；
所選取的蜂王漿是高蛋白，并含有維生素B類和乙酰膽堿等，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、養容美顏等多種作用，所含的免疫球蛋白能明顯的提高人體免疫力，所含的癸烯酸(10-HDA)是自然界中其它物質所沒有的，具有顯著的刺激機體淋巴細胞的活性、消炎殺菌、防癌抗癌等作用；
所選取的蜂蠟其主要成份有:酸類、游離脂肪酸、游離脂肪醇和碳水化合物。此外，還有類胡蘿卜素、維生素A、芳香物質等，中醫學上具有收澀、斂瘡、生肌、止痛的功效； 所選取的葛根提取物含有多種黃酮類成分，主要活性成分為大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，能夠擴張血管，改善血液循環；降低心肌耗氧量，抑制癌細胞；增加冠脈流量，調整血液微循環，降低心腦血管疾病危險；提高肝細胞的再生能力，恢復正常肝臟機能；促進膽汁分泌，防止脂肪在肝臟堆積；促進新陳代謝，加強肝臟解毒功能，防止酒精對肝臟的損傷。經大量的文獻證明，葛根提取物具有改善肝臟器官功能；
所選取的輔酶QlO是人體細胞新陳代謝不可或缺的輔酶，能清除自由基、抵抗氧化，令細胞充滿活力，也可以改善心血管功能，是天然抗氧化劑、自由基清除劑；
所選取的積雪草提取物、綠茶提取物均采用純天然植物提取，富含人體必需營養成分，并具有消炎抗菌等作用，增強人體免疫力，能明顯刺激新生肝細胞的酶合成，改善肝臟器官的自我保護能力，防止自腸道的毒素對肝臟細胞的損壞，產生的酶能夠促進損壞細胞的修復作用；
所選取的亞麻籽油、紫蘇籽油是一種高不飽和度的天然油脂，所含主要成分為a-亞麻酸，最高含量高達50%?70%，是目前所發現的所有天然植物油中這種脂肪酸含量最高的，對護肝、降低膽固醇、降血脂等有顯著作用。
[0010]本發明膠囊內容物的組分優勢互補，清除自由基、活化細胞、添加純天然植物提取物、促進機體再生，充分發揮組分間的協同增效作用，有效地提高了人體的免疫力及改善機體肝臟器官的修復作用。與現有技術相比，本發明的提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其組分科學、搭配合理，提高免疫力效果好，并具有保護臟器之功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現規模化生產。
【具體實施方式】
[0011]下面結合本發明的實施例對本發明做進一步描述。
[0012]實施例1
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經過下列工藝步驟:
Ca)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠25kg、葛根提取物15kg、輔酶Q1(l13kg、積雪草提取物10kg、綠茶提取物10kg、蜂王楽；5kg、亞麻籽油10kg、紫蘇籽油6kg和蜂臘6kg,置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15% ;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Qltl、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內容物物料；再將內容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
Ce)囊材的制作:稱量明膠13.2kg、水13.2kg、甘油5.3kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度26°C，濕度為30%，靜態干燥24小時后，將膠囊出丸；(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0013]本實施例中，軟膠囊體內的內容物的重量百分比分別為:蜂膠25%、葛根提取物15%、輔酶Q1(l13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內的內容物重量比為:1: 3.15。本發明所得的軟膠囊組分合理，劑量科學，提高免疫力效果好，并具有美容、抗衰老、保護臟器的功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現規模化生產。
[0014]實施例2
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經過下列工藝步驟:
(a)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠35kg、葛根提取物10kg、輔酶Q1(l15kg、積雪草提取物9kg、綠茶提取物8kg、蜂王楽；8kg、亞麻籽油5kg、紫蘇籽油7kg和蜂臘3kg,置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15%;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內容物物料；再將內容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:稱量明膠10.4kg、水10.4kg、甘油4.2kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至65°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度24°C，濕度為40%，靜態干燥24小時后，將膠囊出丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0015]本實施例中，軟膠囊體內的內容物的重量百分比分別為:蜂膠35%、葛根提取物10%、輔酶Q1(l15%、積雪草提取物9%、綠茶提取物8%、蜂王漿8%、亞麻籽油5%、紫蘇籽油7%和蜂蠟3% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油約按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內的內容物重量比為:1: 4。本發明所得的軟膠囊組分合理，提高免疫力效果好，并具有保護臟器功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現規模化生產。
[0016]實施例3
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經過下列工藝步驟:
(a)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15kg、葛根提取物18kg、輔酶Q1(l10kg、積雪草提取物13kg、綠茶提取物15kg、蜂王漿4kg、亞麻籽油15kg、紫蘇籽油3kg和蜂蠟7kg，置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15% ;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Qltl、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內容物物料；再將內容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:稱量明膠15kg、水15kg、甘油6kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至60°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度22°C，濕度為35%，靜態干燥24小時后，將膠囊出丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0017]本實施例中，軟膠囊體內的內容物的重量百分比分別為:蜂膠15%、葛根提取物18%、輔酶Q1Q10%、積雪草提取物13%、綠茶提取物15%、蜂王漿4%、亞麻籽油15%、紫蘇籽油3%和蜂蠟7% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內的內容物重量比為:1: 2.8。本發明所得的軟膠囊組分合理，劑量科學，提高免疫力效果好，并具有保護臟器的保健功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現規模化生產。
[0018]下面采用動物試驗來說明本發明的軟膠囊具有提高免疫力、保護臟器的功能。
[0019]1、材料和方法
1.1、受試樣品:按照本發明實施例一提供的提高免疫力、保護臟器軟膠囊生產工藝，生產出500mg/粒軟膠囊樣品。按照人體推薦攝入量為每日2次，每次2粒，即人體每日推薦量為 2.0g/60kg.bw (33.33mg/kg.bw)。
[0020]1.2、試驗動物與組分:實驗動物由山東大學動物實驗中心提供的健康SPF昆明種小鼠，生產許可證號為SCXK (魯)20090001。將實驗動物隨機分為4個免疫大組，每大組55只。
[0021]1.3、實驗環境條件:實驗環境為屏障環境。環境溫度22°C ±2°C，相對濕度50%±10%。實驗動物環境設施合格證號為魯動環字H2002100112號。
[0022]1.4、劑量選擇與受試物給與方式:根據人體推薦量(33.33mg/日/kg.bw),按相當于人體推薦量的5倍、10倍、30倍確定小鼠的低、中、高劑量分別為:0.17g/kg.bw、0.33g/kg.bw、lg/kg.bw,經口每日一次灌胃給予小鼠受試物,灌胃體積按10mL/kg.bw。灌胃前用玉米油溶解并稀釋受試物，對照組分別以等體積的蒸餾水和玉米油代替受試物，連續給予30d后測各項免疫指標。
[0023]1.5、主要儀器與試劑
主要儀器:動物天平、分析天平、潔凈工作臺、游標卡尺(精密度0.01mm)、微量注射器(25 V- L)、CO2培養箱、恒溫水浴、離心機、紫外分光光度計、酶聯免疫檢測儀、光學顯微鏡、微量加樣器(20?200 ii L、100?IOOOii L)。無菌手術器械、200目篩網、玻璃平皿、紗布、試管、血細胞計數器、平底細胞培養板、U型細胞培養板、計時器、血色素吸管、玻片架。
[0024]試劑:綿羊紅細胞(SRBC)、生理鹽水、刀豆蛋白A (ConA)、補體(豚鼠血清)、Hank’s液、青鏈霉素、SA緩沖液、瓊脂糖、MTT、小牛血清、PRMI1640培養液、PBS緩沖液、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯磷酸鹽、氧化型輔酶1、1%冰醋酸、lmol/L HCl,0.1% NP40 (v/v)、酸性異丙醇(96mL 異丙醇加 4mL lmol/L 的 HCl )、YAC-1 細胞、0.2mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液、印度墨汁、lg/L Na2CO3、雞紅細胞、甲醇、丙酮Giemsa染液等。
[0025]1.6、實驗方法:
1.6.1、臟器體重比值測定:小鼠稱重后脫白處死，取其胸腺、脾臟，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污并稱重，計算胸腺體重比值與脾臟體重比值。所得數據，用PEMS統計軟件進行方差分析。
[0026]1.6.2、遲發型變態反應(DTH)(足跖增厚法):取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，致敏后4天，測量左足后跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20%壓積SRBC20 u L，于注射后24h測量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度之差值來表示DTH的程度。
[0027]所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，若受試物組攻擊前后足跖厚度的差值高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有提高小鼠遲發型變態反應能力的作用。
[0028]1.6.3、ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗(MTT法):無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’ s液的小平皿中，制成細胞懸液。用Hank’ s液洗滌2次，每次IOOOrpm離心IOmin0然后將細胞懸液浮于ImL RPMI1640的完全培養液中，計數活細胞數，調整細胞濃度為3X106個/mL。將細胞懸液分兩孔加入培養板中，每孔lmL，在其中一孔加75 ii L ConA液，另一孔作為對照，置于5% C02、37°C孵箱培養68h，每孔加入50 ii L MTT,繼續培養4h。每孔加入ImL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解，然后將液體移入比色杯中，用紫外分光光度計，在570nm波長處測定其光密度值(0D值)。計算試驗孔OD值和對照孔OD值之差，以此表示淋巴細胞的增殖能力。
[0029]所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，若受試物組淋巴細胞的增殖能力高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有提高ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化能力的作用。
[0030]1.6.4、抗體生成細胞測定(Jerne改良玻片法):取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，將SRBC免疫5天后的小鼠處死，取脾，制成細胞懸液。將10g/L瓊脂加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內加10% (v/v，用SA液配制)壓積SRBC 50yL、脾細胞懸液25 yL，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養箱孵育1.5h，然后將補體加入玻片架凹槽內，繼續溫育1.5h后，技術溶血空斑數。
[0031]所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，若受試物組溶血空斑數高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠抗體細胞數的作用。
[0032]1.6.5、小鼠血清溶血素的測定:取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，免疫5天后摘除小鼠眼球，取血于離心管內，放置lh，將凝固血與管壁剝離，離心(2000rpm, lOmin),收集血清。用生理鹽水置約lh，將凝固血與管壁剝離，離心(2000rpm，lOmin)，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度血清分別置于微量血凝試驗板內，每孔100 μ L,再加入0.5% SRBC懸液ΙΟΟμ L，混勻，置于濕盒內，于37°C溫箱孵育3h，記錄血球凝集程度。計算抗體積數。
[0033]血清凝集度分為5級，按以下標準判定。0級:SRBC全部下沉，集中在孔底部形成致敏的圓點狀，四周液體清晰級:SRBC大部分沉積在孔底部形成圓點狀，四周有少量凝集的SRBC ；11級:凝集的SRBC在孔底部形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點；111級:凝集的SRBC均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個紅點；IV級:凝集的SRBC在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。
[0034]所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，若受試物組血清溶血素抗體積數高于對照組，且差異有顯著性(p〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠血清溶血素水平的作用。
[0035]1.6.6、小鼠碳廓清實驗:小鼠尾靜脈注射1: 5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時，注入墨汁后2min、10min，分別從內眥靜脈取血20 μ L，并將其加入2mL Na2C03溶液中。用紫外分光光度計在600nm波長處測光密度值，以Na2C03溶液作空白對照。將小鼠處死，取其肝臟和脾臟稱重。按下式計算吞噬指數a:
K = (lgOD1- lg0D2)/(t2 - ti), a =體重+ (肝重 + 脾重)Xk1/3 ；
所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，若受試物組的吞噬指數高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠單核-巨噬細胞的碳廓清能力的作用。
[0036]1.6.7、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法):小鼠腹腔注射20%壓積雞紅細胞懸液lmL，間隔30min，脫臼處死，取腹腔巨噬細胞洗液lmL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，移入37°C孵箱溫育30min后，于生理鹽水中漂洗，晾干。以1: 1丙酮甲醇固定，4%Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數，每片計數100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數:
吞噬率％=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數X 100 ；
吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞數；
所得數據為計算資料，若受試物組的吞噬率或吞噬指數明顯高于0.000g/kg.bw組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的作用。
[0037]1.6.8、小鼠NK細胞活性測定(乳酸脫氫酶LDT測定法):試驗前24h將YAC-1細胞進行傳代培養，用前以Hank’ s液洗三次，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為4X 105個/mL。將小鼠脫臼處死，無菌取脾，制備脾細胞懸液，用Hank’ s液洗三次，每次lOOOrpm離心lOmin。再用2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養液重懸，用臺酚蘭染色計數，調整細胞濃度為2 X107個/mL，使效靶比為50: 1。
[0038]取靶細胞和脾細胞各100 μ L，加入U型培養板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100 μ L，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%ΝΡ40各100 μ L，上述各項均設三個平行孔，5% C02、37°C培養箱培養4h，將培養板以1500rpm離心5min，每孔取上清液100 μ L置于酶標板中，同時加入LDH基質液100 μ L，反應3min，然后每孔加入lmol/L的HC1 30 μ L終止反應，用酶標儀在490nm處測定0D值。按下式計算NK細胞活性:NK細胞活性％=(反應孔OD-自然釋放孔OD)/ (最大釋放孔OD-自然釋放孔0D) X 100 ； LDH基質液的配制:乳酸鋰5X 10_2mol/L
硝基氯化四氮唑6.6 X l(T4mol/L 吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8X 10_4mol/L 氧化型輔酶I 1.3Xl(T3mol/L 將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中。
[0039]所得數據為計算資料，用PEMS統計軟件進行方差分析，NK細胞活性需按X=SirT1 (P)1/2進行數據轉換，式中P為NK細胞活性，用小數表示，若受試物組的NK細胞活性高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠NK細胞活性能力的作用。
[0040]1.7、實驗數據統計:實驗數據用PEMS統計軟件對各個實驗原始數據進行方差齊性檢驗，滿足“方差齊”要求的數據資料用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理；對方差不齊的數據資料進行適當的變量轉換，待滿足“方差齊”要求后，用轉換所得的數據進行統計處理。
[0041]1.8、結果判定:在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。其中細胞免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定體液免疫功能測定結果陽性。單核-巨噬細胞功能測定項目中的兩個實驗結果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定單核-巨噬細胞功能測定結果陽性。NK細胞活性實驗的一個以上劑量組結果陽性，可判定NK細胞活性測定結果陽性。
[0042]2、 結果
2.1、軟膠囊對小鼠體重的影響:見表1 表1 軟膠囊對小鼠體重的影響 (;±SD)
【權利要求】
1.一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其是由軟膠囊體和封入軟膠囊體內的內容物組成，其特征在于:所述的內容物是由下列組分按重量百分比組成:蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，其組分的重量百分比之和為100%;所述的軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成；所述的軟膠囊體與所述的內容物的重量比為:1: 2?4。
2.根據權利要求1所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其特征在于:所述內容物是由下列重量百分比的組分組成:蜂膠25%、葛根15%、輔酶Q1Q13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6%。
3.根據權利要求1或2所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，所述的蜂膠中含總黃酮不低于15% ;所述的葛根提取物中所含有的葛根素不低于4%。
4.根據權利要求1所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，其特征在于:經過下列工藝步驟:(a)過篩:將葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；(b)粉碎:將蜂膠塊按照比例稱量后，進行粉碎，備用；(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，依次置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內容物物料；再將內容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；(e)囊材的制作:將明膠、水、甘油按100: 100: 40比例稱料，投送到化膠罐中，攪拌升溫至60?75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫容器內，備用；(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內容物物料按照重量比:1: 2?4的比例送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；(g)定型干燥:控制溫度22?26°C，濕度為30?40%，靜態干燥24小時后，將膠囊出丸；(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
【文檔編號】A23L1/29GK103734696SQ201310587779
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】王麗娜 申請人:榮成百合生物技術有限公司