一種植物乳桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種植物乳桿菌及其應用，具體涉及一種新的植物乳桿菌LP45（YMC1005），CGMCC?NO.8072；還涉及植物乳桿菌LP45在降低膽固醇、提高免疫力，抑制腸道有害菌方面的應用。
【專利說明】一種植物乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種乳桿菌屬的新菌株，更準確地說，本發明描述了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的一個新菌株LP45,屬于生物【技術領域】。
【背景技術】[0002]益生菌對人類的健康有很大幫助，科學家們已對其進行了幾十年的研究，現已證明在腸胃調節、抗氧化、降膽固醇、預防胃腸道癌癥、免疫調節等方面均起到很好的作用。但是，益生菌的菌株種屬范圍非常廣，即便同一種屬的不同菌株之間個體差異都非常大，所以篩選工作非常困難，現在益生菌的應用中普遍存在攝入人體后生存率不高，對胃腸的吸附能力不強，在增強人體免疫力和抑制致病菌能力方面的表現不理想。因此，是否研究篩選到益生功能最優越的菌株作為益生菌應用就成為了如今益生菌研究的關鍵所在。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種商業編號為LP45,保藏編號為YMC1005的植物乳桿菌，它具備在人體胃腸中具有很高的生存率、較強的胃腸粘附力，提高人體免疫力的功能，能顯著抑制胃、腸道致病菌，具備降低膽固醇的潛力，另一方面提供上述新菌株的用途。
[0004]為實現上述目的，本發明所采取的技術方案為:
一種植物乳桿菌LP45，該植物乳桿菌已經于2013年8月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為:CGMCC N0.8072。
[0005]植物乳桿菌LP45具有胃腸道吸附能力。
[0006]植物乳桿菌LP45具有抑制胃腸道致病菌的功能。
[0007]植物乳桿菌LP45具有降低膽固醇的功能。
[0008]植物乳桿菌LP45具有提高免疫力的功能。
[0009]植物乳桿菌LP45用于制備抑制胃腸道致病菌的藥品或食品。
[0010]植物乳桿菌LP45用于制備降低動物或人類體內膽固醇濃度的藥品或食品。
[0011]植物乳桿菌LP45用于制備提高免疫力的藥品或食品。
[0012]上述食品主要包括普通食品、減肥食品、保健食品。
[0013]在發明所提供的體外試驗證實，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)具備良好的耐酸性及耐膽鹽性，在胃腸道中生存率較高，并具備較強的胃腸道吸附能力，具備提高免疫力的功能，可有效抑制有害菌的繁殖，本發明所提供的菌株可顯著降低膽固醇含量，在對心血管疾病的預防或治療中具備較大潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)的基因指紋圖譜。
[0015]在圖1中:Μ為Maker、1為植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)、2為植物乳桿菌ATCC14917。[0016]菌種保存
本發明菌種命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) LP45,于2013年8月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為:CGMCCN0.8072。保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
【具體實施方式】
[0017]下面將結合附圖和實施例對本發明進行進一步詳細的說明。
[0018]實施例1菌株的篩選和保藏
本發明的植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)是自內蒙古烏蘭察布市四子王旗烏蘭哈達蘇木站烏蘭哈達嘎查的傳統酸奶酪中分離篩選獲得，具體分離鑒定步驟如下:
將內蒙古四子王旗酸奶酪樣品溶解于滅菌生理鹽水試管中，充分震蕩混勻，混勻后使用接菌環蘸取混合液體并于MRS平板上劃線培養(37°C 72h)，分離菌株。用接菌環從第一代平板挑取單菌落，在新MRS平板上劃線培養(37°C 72h)，進行純化。同樣方法再純化2次，使最終平板上為同一形態菌落為止。挑取單菌落接菌于MRS液體培養基中37°C培養18h，以備保藏和鑒定使用。
[0019]將液體培養基菌懸液收集至滅菌離心管中，清洗離心2次，進行基因組DNA的提取，提取完畢后，利用通用引物27f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1495r:5_’ CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ 進行 16S rDNA 的 PCR 實驗，完成 PCR 后將最終 PCR 產物進行測序，并將測序結果與Gene Bank中相關序列進行比較，比較結果顯示LP45 (YMC1005或L45)屬于植物乳桿菌。
[0020]將LP45 (YMC1005或L45)及ATCC14917 (植物乳桿菌)菌株的純培養液進行清洗離心，將獲得的菌體進行基因組DNA的提取，提取完畢后，利用隨機引物5’ -GACGGATCAG-3’進行RAPD實驗，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并進行凝膠成像，對比兩株植物乳桿菌的電泳條帶，結果顯示，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)與植物乳桿菌ATCC14917屬于同一種屬的不同菌株，結果見附圖1。將植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)于2013年8月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為:CGMCCN0.8072。
[0021]實施例2胃腸道生存率試驗
采用人工消化液實驗(胃酸抵抗性以及膽汁酸抵抗性)來研究植物乳桿菌LP45(YMC1005)在人的腸道環境下的生存性。
[0022]1、耐酸性試驗
植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)由凍存管活化，經3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接種于4支pH3.0 (使用鹽酸調pH)的液體MRS培養基試管，每支試管裝有10ml的液體MRS培養基。取1支pH3.0的液體MRS培養基試管3%接種后用于測Oh的活菌數；另三支pH3.0的液體MRS培養基試管3%接種后用于測4h的0D600，取其中兩支測活菌數。
[0023]存活率=4h活菌數/Oh活菌數*100%
2、耐膽鹽試驗
植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)由凍存管活化，經3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接種于4支0.3%膽鹽(sigma膽鹽)的液體MRS培養基試管，每支試管裝有10ml的液體MRS培養基。取1支0.3%膽鹽的液體MRS培養基試管3%接種后用于測Oh的活菌數;另三支0.3%膽鹽的液體MRS培養基試管3%接種后用于測4h的0D600，取其中兩支測活菌數。
[0024]存活率=4h活菌數/Oh活菌數*100%
結果和結論:經試驗得到LP45(YMC1005或L45)在pH3.0的液體培養基中，4小時后的存活率達到了 122.4%，高于競品鼠李糖乳桿菌11^ (98.9%)及嗜酸乳桿菌從^11 (51.2%)；在0.3%膽汁酸的液體培養基中，4小時后生存率達到了 47.8%。高于競品菌株LGG (1.3%)及 NCFM (2.1%)。
[0025]眾所周知，益生菌在被攝取后需經受消化液的考驗才能到達腸道，本實驗結果證明了 LP45 (YMC1005或L45)具備較高的胃腸道生存率，也顯示了菌株作為益生菌開發的潛力。[0026]實施例3胃腸道吸附能力試驗
采用LP45 (YMC1005或L45)菌株吸附Caco_2細胞來研究LP45 (YMC1005或L45)菌株對胃腸道上皮細胞的吸附能力，發現LP45 (YMC1005或L45)粘附力為72。
[0027]具體的操作步驟為:
1、將人體腸道細胞株Caco-2以1ml 0.05%胰島素處理5min后，將細胞輕輕拍下，分裝于96孔的培養盤中，每個孔洞中加入lOOOOcells，每天換200 μ 1新鮮的DiffiM培養基。
[0028]2、植物乳酸桿菌LP45 (YMC1005或L45)分別以MRS活化兩次后，接種至5mlMRSbroth進行培養，于24小時后取lml以6000rpm離心10分鐘后，以PBS (pH 7.2)清洗兩次得到乳酸菌菌液。加入20 μ 1乳酸菌菌液于步驟1的細胞中，接著培養1小時使乳酸菌附著，
3、乳酸菌附著1小時后，倒除培養基，以PBS緩沖液洗5次以去除未附著的乳酸菌，加入100μ 1，10%福爾馬林，30分鐘，固定細胞及細菌，再以PBS緩沖液洗3次，最后以100 μ 1結晶紫進行染色，五分鐘后以少量75%酒精快速沖洗，去除細胞上的染色劑。
[0029]4、利用相位差顯微鏡觀察乳酸菌對腸道上皮細胞的吸附性，隨機在不同的顯微鏡視野下，觀察并計算50個細胞的乳酸菌吸附情形，最后計算每個細胞平均吸附的乳酸菌數量。
[0030]經試驗結果可知，本發明植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)的粘附力72，粘附力較強。篩選益生菌的一個重要指標就是其對胃腸道上皮細胞和粘膜的粘附力。粘附力強的益生菌在腸粘膜的定殖時間也相應有所延長，這對于發揮益生菌的免疫調節作用和刺激修復腸道損傷部位具有重要意義。
[0031]實施例4免疫力試驗
采用 Caco-2 細胞，10%FBS 的 RPM1640 培養基在 37°C，5%C02 條件下與 LP45 (YMC1005或L45)菌株共培養，發現LP45 (YMC1005或L45)菌株無論是活菌還是加熱失活后都能夠顯著調節Caco-2細胞中IL-6和IL-8的表達。
[0032]采用小鼠巨噬細胞(J774.1)，10%FBS的RPM1640培養基在37°C，5%C02條件下與LP45 (YMC1005或L45)菌株共培養，發現LP45 (YMC1005或L45)菌株明顯促進了 IL-6的分泌，使IL-6表達量由0提高到了 110ng/ml。[0033]由試驗結果可見，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)具備增強免疫力的功能。
[0034]實施例5膽固醇含量測定試驗
1、繪制標準曲線
精確量取膽固醇標準液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4ml、1.6ml
置于干燥試管中，并用無水乙醇定容至2.0ml，再沿壁緩慢加入2.0ml硫酸鐵銨顯色液，震蕩混勻，待冷卻至室溫，與紫外分光光度計560nm處測定吸光度。以膽固醇濃度為橫坐標，0D560為縱坐標，繪制標準曲線。
[0035]2、膽固醇測定
a.物乳酸桿菌LP45 (YMC1005)在MRS液體培養基中活化3代，按麥氏比濁法調菌濃度為3.0 X 109CFU/ml按2%的接種量接種到含膽固醇的MRS液體培養基中37 °C培養，分別培養 24 h、48h。
[0036]b.取培養液0.2 mL置于干燥離心管中，先加0.8 mL無水乙醇，搖勻后，再加4 mL無水乙醇(無水乙醇分2次加入，目的使蛋白質以分散很細的沉淀析出)，加蓋，快速混勻器混勻，離心(10000 r/min, 15 min)。
[0037]c.用微量移液器準確移取上清液2 mL加入到比色管內，再加入2 mL硫酸鐵銨顯色液，加入時要沿管壁緩慢加入，使兩液間保持明顯界面，加完后充分振搖混勻(不能邊加邊搖)，以便產生高熱(大于80 °C)促進顯色。
[0038]d.將各管放置15 min，待管內反應液冷卻至室溫，在30~60 min內在分光光度計上于560 nm處測定吸光度。以2 mL無水乙醇加2 mL硫酸鐵試劑為空白管，以未接菌的含膽固醇的MRS液體培養A0560為標準值。
[0039]e.膽固醇降解率=(A0560- A560) / A0560X100%。
[0040]結果和結論:經試驗，LP45 (YMC1005或L45)膽固醇降解率為80.2%，略低于競品菌株NCFM (89.6%)，高于菌株1^6 (34.7%)，說明其具有很強的膽固醇脫除能力。
[0041]實施例6抑菌試驗
包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌實驗。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌使用LB液體培養基活化18h后，稀釋到105-106cfu/ml取200ul均勻涂抹到LB固體培養基培養皿中，半小時后擺放牛津杯，每個培養皿擺放3個,分別標為A、B、C, A代表培養液原液、B代表調pH5.5后的培養液原液、C代表調pH5.5后的培養液原液稀釋10倍。每個牛津杯加入300ul，37°C培養24h后測量抑菌圈。
[0042]經檢測，該菌株大腸桿菌抑菌圈為11.98_，對金黃色葡萄球菌抑菌圈為24.8_。結果顯示LP45 (YMC1005或L45)對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用。
[0043]以上所述實施方式僅為本發明的優選實施例，而并非本發明可行實施的窮舉。對于本領域一般技術人員而言，在不背離本發明原理和精神的前提下對其所作出的任何顯而易見的改動，都應當被認為包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種植物乳桿菌LP45，該植物乳桿菌已經于2013年8月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為:CGMCC N0.8072。
2.根據權利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有胃腸道吸附能力。
3.根據權利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有抑制胃腸道致病菌的功能。
4.根據權利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有降低膽固醇的功能。
5.根據權利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有提高免疫力的功能。
6.—種如權利要求1-5任一項所述的植物乳桿菌LP45的應用，其特征在于:用于制備抑制胃腸道致病菌的藥品或食品。
7.—種如權利要求1-5任一項所述的植物乳桿菌LP45的應用，其特征在于:用于制備降低動物或人類體內膽固醇濃度的藥品或食品。
8.—種如權利要求1-5任一項所述的植物乳桿菌LP45的應用，其特征在于:用于制備提聞免疫力的藥品 或食品。
【文檔編號】C12R1/25GK103642716SQ201310587738
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】趙林森, 齡南, 葛春美, 馬新穎, 齊世華 申請人:河北一然生物科技有限公司