一種菌種保藏方法
【專利摘要】本發明涉及一種菌種保藏方法，該方法是將菌種與10%甘油、2%海藻糖溶液制備的冷凍保護劑混合，放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于-80℃冰箱內凍存。保藏的菌種取用時，按照凍存盒蓋上的標記可快速查找到所需的凍存管菌種。凍存管取出后，立即放入35～40℃的水浴中進行快速、震蕩解凍，直到全部融化為止。在無菌操凈臺下打開凍存管，將內容物移入適宜的培養基上培養。采用本發明方法保藏的菌種，大大降低了保藏成本，無需購買專用設備，所用冷凍保護劑價廉易采購，凍存管制備程序簡單、耗時短，存活率高、純度高、傳代5代內穩定性好。
【專利說明】一種菌種保藏方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物發酵【技術領域】，特別是涉及一種在超低溫冷凍條件下，保護菌種穩定性及其代謝活性的保藏方法。
【背景技術】
[0002]工業生產中常用的幾種菌種保藏方法包括:定期移植法、液體石蠟油保藏法、沙土管保藏法、冷凍真空干燥法、液氮超低溫凍結法、-80°C低溫冷凍保藏等待。這些菌種保藏方法各有其優點和缺點。例如定期移植法，斜面在保藏期間培養基的水分易于蒸發而收縮、干涸、塌陷，使其濃度增高，滲透壓加大，因而會引起菌種退化甚至死亡；連續傳代后一些有利性狀會減弱；易造成雜菌污染。液體石蠟油保藏法:石蠟油多為化學純，若含有雜質，尤其是有毒物質，應用于菌種保藏則會影響菌種的生產性能；在保藏過程中石蠟油會因為蒸發減少，而致使斜面培養物露出，若不及時補加，會引起菌種退化甚至死亡；保藏的斜面須直立放置，占據的儲存空間太大，對儲存設備需量大。沙土管保藏法:保藏載體之一的土，要取于貧瘠土，取材存在要求高；沙、土需要洗滌、除雜、除鐵屑；沙土管中沙土的比例不固定，受沙土質量和菌種特性所影響，往往需要通過試驗而定；存活率低、變異率高。冷凍真空干燥法:對設備的要求高，制備耗時長，對操作人員的技能要求高。液態氮超低溫凍結法:需要先慢速冷凍至-40°C，然后再放入液氮罐內速冷至-150°C進行保存；操作相對繁瑣，對設備要求也高。
【發明內容】
[0003]本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種操作方便、簡單易行、可操作性高、生物安全性高、保存效能高、保藏成本低的菌種保藏方法。
[0004]為實現上述發明目的所采取的技術方案為:
[0005]本著單一保護劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣條件的客觀情況，本發明所提供的液體菌種的保藏方法是:
[0006]1、冷凍保護劑的制備:按終濃度分別配制10%甘油和2%海藻糖溶液。經119~12rC、30min滅菌，得到冷凍保護劑。
[0007]2、將菌種與復合冷凍保護劑混合后，用凍存管分裝好后放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于_80°C冰箱內直接一步凍存。
[0008]3、復蘇操作時，從冰箱中取出制品，立即放置35V -40°C水浴中快速搖動復蘇，使得內部結冰全部溶解為止。
[0009]采用本發明的保藏方法，在現有超低溫保藏技術的方法上，大大降低了保藏成本，無需購買專用設備，所用冷凍保護劑價廉易采購，凍存管制備程序簡單、耗時短。存活率高、純度高、傳代5代內穩定性好。
[0010]與單一采用高濃度甘油做保護劑相比，有以下優點:能消除懸浮在保護劑中的菌樣的不均勻狀態；能確保制品的質量；給傳代生長創造了良好的環境。保證了蛋白質的穩定性。冷凍保存過程中無需實施程序降溫，查找與復蘇操作方便。
【具體實施方式】
[0011]1、用種液做菌種保藏的流程:
[0012]生產菌株凍存管一活化一代一活化二代一活化三代一自然選育一搖瓶初篩、復篩—性能優良菌種保藏
[0013]2、用斜面孢子做菌種保藏的流程:
[0014]生產菌株凍存管一分離平板一制備斜面一自然選育一種子液制備一發酵液接種—搖瓶初篩、復篩一性能優良斜面保臧
[0015]3、用純化的單菌落做菌種保藏的流程:
[0016]生產菌株斜面一自然選育一分離平板一單菌落一對一點種一性能優良單菌落保藏。
[0017]實施例
[0018]冷凍保護劑的制備:按終濃度分別配制10%甘油和2%海藻糖溶液。經119~12rC、30min滅菌，得到冷凍保護劑。
[0019]1、種液做菌種保藏
[0020]1.1接種液體培養基，恒溫振蕩培養后，用刻度吸管精確吸取菌懸液1ml~2ml入耐高溫、冷凍離心管內，經8000~10000rpm/min高速離心，棄去上清液，補加1ml~2ml冷凍保護劑，在漩渦混合器上使之與菌體充分混勻。
[0021]1.2凍存管菌種的保存:將上述分裝好菌液的凍存管放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于-80 V超低溫冰箱內保存。
[0022]1.3凍存管菌種的恢復培養:保藏的菌種取用時，將按照凍存盒盒蓋上的標記可快速查找到所需的凍存管菌種。凍存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中進行快速、震蕩解凍，直到全部融化為止。在無菌操凈臺下打開凍存管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
[0023]2、斜面孢子做菌種保藏
[0024]2.1在斜面瓶內注入冷凍保護劑(茄瓶斜面:10~15ml ； Φ 32*320_的試管斜面:5~8ml)，用纏有脫脂棉花的接種環輕輕刮取培養物斜面上的孢子(注意勿帶起培養基)，將孢子懸浮液轉入帶有玻璃珠的三角燒瓶內，置于搖床上震蕩，得到均一分散的單孢子懸浮液。用刻度吸管精確吸取1.0-2ml (根據用途確定)菌懸液入凍存管內，旋緊蓋子。
[0025]2.2凍存管菌種的保存:將上述分裝好菌液的凍存管放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于-80 V超低溫冰箱內保存。
[0026]2.3凍存管菌種的恢復培養:保藏的菌種取用時，將按照凍存盒盒蓋上的標記可快速查找到所需的凍存管菌種。凍存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中進行快速、震蕩解凍，直到全部融化為止。在無菌操凈臺下打開凍存管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
[0027]3、用純化的單菌落做菌種保藏
[0028]3.1將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(0 0.5-1.0cm)，加入盛有1~2ml冷凍保護劑的凍存管內，置于漩渦混合器上使之充分混合打散。
[0029]3.2凍存管菌種的保存:將上述分裝好菌液的凍存管放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于-80 V超低溫冰箱內保存。
[0030]3.3凍存管菌種的恢復培養:保藏的菌種取用時，將按照凍存盒盒蓋上的標記可快速查找到所需的凍存管菌種。凍存管取出后，立即放入35~40°C的水浴中進行快速、震蕩解凍，直到全部融化為止。在無菌操凈臺下打開凍存管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
[0031]4、鋪展性和滲透性考察
[0032]
保
【權利要求】
1.一種菌種保藏方法，其特征是:將需保藏的菌種與冷凍保護劑混合分裝，將分裝好的菌液凍存管放入100孔凍存管盒內，盒蓋上做好標記，置于-80°C超低溫冰箱內保存。
2.按照權利要求1所述的菌種的保藏方法，其特征在于冷凍保護劑的制備是按終濃度分別配制10%甘油和2%海藻糖溶液，經119~121°C、30min滅菌，得到冷凍保護劑。
3.按照權利要求1所述的菌種的保藏方法，其特征在于保藏的菌種取用時，按照凍存盒蓋上的標記取出凍存管后，立即放入35~40°C的水浴中進行快速、震蕩解凍，直到全部融化為止，在無菌操 凈臺下打開凍存管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
【文檔編號】C12N1/04GK103667061SQ201310586921
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】崔莉, 孫瑞君, 馬學霞, 張志
申請人:寧夏啟元藥業有限公司