質譜儀鑒定血清中游離dna的方法、試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應用。所述方法包括PCR反應、PCR產物純化、單堿基延伸、延伸產物純化、質譜儀檢測的步驟；所述試劑盒包括PCR反應試劑、純化試劑及單堿基延伸反應試劑。本發明相比于現有技術具有靈敏度高、特異性強、簡便安全、速度快、高通量、更節約時間等優點。
【專利說明】質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應用，具體而言是利用PCR技術、單堿基延伸技術和質譜技術，選用Kras基因對血清中游離DNA進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002]游離循環核酸是一種存在于人的體液中的細胞外游離狀態核酸。游離循環DNA的分子大小在500bp~30kb之間。正常人外周血中游離DNA主要來自細胞核DNA和線粒體 DNA，其含量較少，而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細胞。
[0003]近年來，隨著對游離核酸研究的不斷深入，游離DNA的檢測已經在疾病監控、胎兒產前診斷和腫瘤研究中取得眾多進展。檢測惡性腫瘤患者血液中游離DNA用于基因診斷已成為研究熱點，且研究顯示血液中游離DNA有可能成為一種新的腫瘤診斷及預后判斷的標志物。游離DNA是存在于血液、滑膜液等體液中的細胞外游離DNA。研究發現許多腫瘤患者游離DNA與正常人相比有很大差異。游離DNA檢測避免了當前分子診斷需要采集癌組織作為標本來源的困難，是一種有潛力的腫瘤標志物。
[0004]近年研究發現在外周血液中能夠檢測到早期腫瘤細胞逸出的突變DNA，成為良好的腫瘤診斷、治療預后的生物標記。Kimura等(2006年)報道能夠在循環血液中檢測到Kras 突變，認為檢測這些外周血液中的突變DNA，可以知道患者體內是否存在微小病灶、腫瘤手術后是否存在轉移、靶向藥物靶標位點的分子學特征等，從而作出相應治療方案。因此，檢測Kras基因的突變，還將有助于評價治療效果，有助于對腫瘤發病風險進行預測，有助于對腫瘤轉移進行早期診斷。
[0005]由于血液中游離DNA的含量很低，通常每毫升僅為納克水平，已經大大超出傳統的溴化乙啶染色和紫外分光光度儀等實驗室常用的DNA定量方法的檢測范圍。而熒光定量 PCR方法涉及到熒光染料，容易引起假陽性。
[0006]申請號為200910177851.2的中國發明申請文件提供了一種檢測KRAS基因和/或 BRAF基因的核苷酸突變位點的方法，該方法在一定程度上提高了檢測的靈敏度和準確度， 但是其檢測速度仍不能滿足現狀的需求。所以本領域需要一種不僅具有高靈敏度和準確度，而且能真正提高速度的檢測游離DNA的方法。
【發明內容】
[0007]本發明提供一種高靈敏度、準確的檢測游離DNA的方法，以克服現有技術的不足。 具體是一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，該方法的技術原理為:利用聯合PCR技術、 單堿基延伸技術和質譜檢測技術，對血清中游離DNA進行檢測；其中:在單堿基延伸過程中，對PCR的純化產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在突變處分別延伸一個核苷酸，使得所延伸的核苷酸類型，分別與突變處的基因型相關；單堿基延伸產生由延伸引物和延伸產物組成的待檢混合物，以質譜對待檢混合物進行檢測，通過質譜峰確定待檢混合物中各物質分子量，并與預先計算的各延伸引物和延伸產物的理論分子量進行比對，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質，進而確定各突變處的基因型。
[0008]本發明目的是提供一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，包括如下步驟:
(1)PCR反應:游離DNA中Kras基因進行PCR擴增，得到含Kras基因12密碼子和13 密碼子區域的PCR產物；所述PCR擴增是用序列為SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物進行擴增；
(2)PCR產物純化:對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，以減少對后續反應的干擾；
(3)單堿基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特異性的延伸引物，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與SNP位點處的基因型互補配對；所述特異性的延伸引物為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一條或幾條；
(4)延伸產物純化:對步驟(3)得到的延伸產物進行純化；以獲得高純的延伸產物，避免鹽離子等雜質對后續檢測的影響；
(5)質譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行檢測。
[0009]上述方案中優選的是，步驟(1)中所述突變的基因名12S、12R、12C、12D、12A、12V、 13D中的任一種或幾種，所述12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D基因序列分別為AGT-GGC， CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-G^C，帶下劃線的為突變后的堿基。
[0010]上述任一方案中優選的是，步驟(1)中所述引物I和引物2的5’端都增加3-15個保護堿基序列，以使PCR引物的分子量增大，從而避免PCR引物進入質譜儀檢測窗口而干擾檢測效果。
[0011]上述任一方案中優選的是，所述引物I和引物2的5’端都增加的保護堿基序列為:ACGTTGGATG。
[0012]上述任一方案中優`選的是，步驟(1)中所述PCR擴增是用dNTPs、MgCl2進行擴增， 所述 dNTPs 為 dATP、dTTP, dGTP、dCTP。
[0013]上述任一方案中優選的是，步驟(1)中所述PCR擴增是用Taq酶進行擴增。
[0014]上述任一方案中優選的是，步驟(1)中所述PCR擴增經變性、退火、延伸三個步驟； 所述變性溫度為95°C，所述退火溫度為56°C，所述延伸溫度為72°C。
[0015]上述任一方案中優選的是，所述變性時間為10秒，所述退火時間為10秒，所述延伸時間為30秒。
[0016]上述任一方案中優選的是，步驟(2)中所述PCR產物純化是利用SAP酶純化。
[0017]上述任一方案中優選的是，所述SAP酶純化是先在溫度為37°C下純化45分鐘，然后在溫度為85°C下15分鐘使SAP酶高溫失活。
[0018]上述任一方案中優選的是，步驟(3)中所述單堿基延伸經過變性、退火、延伸三個步驟，所述變性溫度為94°C、退火溫度為52°C、延伸溫度為72°C。
[0019]上述任一方案中優選的是，所述變性時間為5秒、退火時間為5秒、延伸時間為5秒。
[0020]上述任一方案中優選的是，步驟(4)中所述延伸產物純化是向延伸產物中加入純化水和樹脂，混勻后純化。[0021]上述任一方案中優選的是，所述純化時間為30分鐘。
[0022]上述任一方案中優選的是，步驟(5)中所述質譜儀檢測是利用飛行時間質譜儀對點樣后的靶片進行檢測和結果判斷。
[0023]上述任一方案中優選的是，所述飛行時間質譜儀包括激光器、真空系統、質量分析器、電子數據系統、系統狀態檢測卡、觸摸屏電腦、樣品室和數據處理系統。
[0024]上述樣品室的第一個作用是作為放取、承載靶板的工具，它能夠確保靶板可以在短時間內方便的放取，并平穩的固定在底座上；第二個作用是輔助保持儀器真空度，防止飛行管中的真空環境被放取靶板的開放性的過程破壞；第三個作用是精確定位和靶板微距移動，通過微距步進電機的使用，可以使靶板進行微距移動以達到選擇靶環上不同靶點的目的。
[0025]上述任一方案中優選的是，所述激光器為氮氣激光器、半導體激光器、光纖激光器中的任一種。
[0026]上述任一方案中優選的是，所述光纖激光器是用摻稀土元素的玻璃光纖作為增益介質的激光器。光纖激光器擁有制造成本低及其光纖的可饒性所帶來的小型化、集約化優勢；它所采用的玻璃材料具有散熱快，轉換效率較高，激光閾值低的特點；而且光纖激光器的諧振腔內無光學鏡片，具有免調節、免維護、高穩定性的優點；同時它還擁有很高的電光效率，綜合電光效率高達20%以上。
[0027]上述任一方案中優選的是，所述氮氣激光器包括脈沖激光器和激光光路。60Hz激光器的使用能使數據更快的生成，間接地提高了儀器的分析速度。
[0028]上述任一方案中優選的是，所述激光光路采用自動對焦。
[0029]上述任一方案中優選的是，所述自動對焦是通過光學透鏡的組合使激光斑點在 50um至200um之間可調。這樣就能充分滿足不同樣品的實驗需求，能使激光斑點大小與共振結晶體的大小相匹配，確保獲得全面的離子信息。該激光光路設計方案所提供的對焦范圍是同類產品中最寬的。
[0030]上述任一方案中優選的是，所述真空系統包括差動抽取泵。樣品在離子化過程和后續的離子自由飛行過程中均需要較高水平的真空度。在離子源中，`電離過程需要10_5Pa 的高真空度以避免放電現象發生；在飛行管中則需要高達10_6Pa的真空度以避免離子飛行時和氣體小分子碰撞而造成能量損失。在真空系統上采用了先進的真空差動抽取泵的方案，即在兩臺串聯的真空泵的作用下形成梯度真空差，以差動抽取的方式快速的形成高真空環境。這種先進的抽真空方式可以保證飛行管內的真空環境不受離子源的壓強變化而波動，提高了儀器的分辨率和靈敏度。
[0031]上述任一方案中優選的是，所述差動抽取泵包括分子渦輪泵和隔膜泵。
[0032]上述任一方案中優選的是，所述質量分析器包含延時提取裝置、飛行管、檢測器和控制電路。質量分析器是基質輔助激光解析儀的一個關鍵部件，它的好壞決定了儀器分離樣本的能力，是科學儀器分辨率和準確度的關鍵。
[0033]上述任一方案中優選的是，所述電子數據系統包含了數據信號轉換板、信號輸入輸出控制主板、信號輸入輸出控制副板、信號獲取與傳輸控制板、高低電壓控制板。信號會由離子到達檢測器的次數和順序的最初始狀態經放大器放大并傳輸到信號獲取與傳輸控制板，經數據信號轉換板運算和擬合后生成表達譜圖譜。數據分析處理系統需要較高的電子電路設計基礎和對表達譜信號的深刻理解，電路設計的小型化也需要對電子器件排布有較高的認識，還需要避免高集成度設計對板路系統穩定性帶來的干擾。具體技術路線為: (I)采用微通道板作為信號放大器；(2)使用高通量的數據轉化和處理設計；(3)制作小型化，集成度高的數據板路系統。
[0034]微通道板的使用可以提高儀器的靈敏度。高通量的轉化和處理設計可以使檢測信號快速的得到接收和分析，減少數據溢出的發生。小型化，集成度高的數據板路系統可以使儀器進一步縮小儀器整體尺寸，降低儀器功耗。
[0035]數據板路系統需要較高的電子電路設計基礎和對表達譜信號的深刻理解，電路設計的小型化也需要對電子器件排布有較高的認識。在原有基礎板路上的重排和集成是整個系統的關鍵，高集成度的設計會對板路系統的穩定性帶來一定的困難。
[0036]上述任一方案中優選的是，所述系統狀態檢測卡包括集成電路板和檢測系統；系統狀態檢測卡可以用來隨時檢測多個系統的運行狀態，并做出簡單的問題判斷。具體技術路線為:(1)為不同的系統如真空系統，控制系統，進樣系統等設計檢測接口 ；(2)設計系統狀態檢測卡并集成通路開關并開發相應的底層檢測軟件。
[0037]設計出能正確反饋各系統狀態的集成電路板和具有簡單判斷能力的檢測系統需要對各個系統的信號傳輸和控制深入了解，需要預分析可能出現的問題并為這些問題的狀態設計反饋讀取和判斷方案。
[0038]上述任一方案中優選的是，所述觸摸屏電腦安裝在質譜儀機箱內部，直接與質譜儀數據輸出端連接，并與質譜儀共享電源觸摸屏電腦。與基質輔助激光解析科學儀器共享電源以提高整體集成度，同時使操作更加方便簡單。
[0039]上述任一方法在鑒定血清中游離DNA的過程中的應用。
[0040]上述任一方法在檢測基因突變時的應用。
[0041]本發明的另一目的是提供一種鑒定血清中游離DNA的試劑盒，該試劑盒用于鑒定血清中游離DNA的方法中，所述試劑盒包括:
(1)PCR反應試劑，包括:PCR引物、耐高溫的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反應緩沖液、 buffer ;所述 PCR 引物為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；
(2)PCR產物純化試劑；
(3)單堿基延伸反應試劑，包括:延伸引物、耐高溫的單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應緩沖液；所述耐高溫的單堿基延伸酶是iPLEX Pro酶；所述延伸引物為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5中的任一條或幾條。
[0042]上述案中優選的是，所述耐高溫的DNA聚合酶為Taq酶。
[0043]上述任一方案中優選的是,所述PCR反應緩沖液為Tris-CL緩沖液。
[0044]上述任一方案中優選的是，所述PCR引物的5’端包含有保護堿基，所述保護堿基序列為5-15個堿基序列。
[0045]上述任一方案中優選的是，所述保護堿基序列為ACGTTGGATG。
[0046]上述任一方案中優選的是，所述PCR產物純化的試劑為堿性磷酸酶、堿性磷酸酶和外切酶Exo1、電泳凝膠回收試劑、PCR產物純化柱中的任一種或幾種。其中當包括堿性磷酸酶和外切酶ExoI的純化試劑時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。
[0047]上述任一方案中優選的是，所述試劑盒還包括外切酶、點樣及質譜檢測用靶片、基因組DNA提取試劑等試劑。
[0048]上述任一方案中優選的是，所述基因組DNA提取試劑包括細胞裂解液、蛋白酶、純化液、漂洗液。
[0049]上述任一種檢測試劑盒在鑒定血清中游離DNA的方法中的應用。
[0050]本發明優點如下:
1.靈敏度高:本發明綜合了 PCR、單堿基延伸、質譜檢測等技術為一體，既可通過PCR技術放大檢測模板，又可通過質譜技術檢測微量樣本，綜合了兩種技術的優點，遠遠優于單獨使用PCR檢測基因突變，因此它的檢測靈敏度很高。
[0051]2.特異強:單堿基延伸又稱為“微測序”，使用特異性探針對DNA分子進行識別，具有測序技術的高準確性，特異性好、假陽性低等特點；特別的，不同于測序技術延伸數百個堿基，該技術僅延伸單個堿基，出錯概率更低。
[0052]3.簡便安全:操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。
[0053]4.相比于現有的技術:速度快、高通量，更節約時間，可在3.5小時左右內完成數百個樣本的檢測。
5.本發明中采用的質譜儀基于紫外光纖激光器的創新離子源設計，實現能量輸出更穩定，更高離子化效率，并延長使用壽命；采用創新的離子推斥技術的高真空度飛行管設計， 在離子加速前對影響測量精度的離子初速度和方向進行校正，同時通過引入二階無網離子反射器增加離子的飛行時間，大幅提高儀器的分辨率；采用人機交互更便捷的觸摸屏一體機設計，降低儀器的應用難度，拓展儀器的應用范圍；基于高集成度的電子電路系統，設計創新的儀器故障檢測卡，便于儀器使用維護。在進行鑒定血清中游離DNA的過程中提高了對點樣后的靶片檢測的速度，也提高了對結果判斷的靈敏度和準確度。
[0054]本發明中相關術語定義 本發明中，所述 Kras 基因即為 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog ;所述 iPLEX Pro 酶即為 ThermoSequenase。
[0055]本發明提供了一種聯合PCR、單堿基延伸和質譜檢測等技術，檢測血清中游離DNA 的方法。其原理在于:
在PCR步驟中，通過設計并使用合適的引物從而擴增Kras基因12、13密碼子所在DNA 片段。
[0056]在單堿基延伸步驟中，對上一步PCR的產物依次進行純化和多重單堿基延伸。其中，延伸引物共3條，分別與7個突變位點對應，并在對應的突變位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與突變位點處的基因型互補配對(如某突變位點處是A基因型，將在對應的延伸引物上延伸T核苷酸)。在單堿基延伸步驟中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一個堿基后，延伸引物將終止延伸。本發明中不加入野生型對應的堿基，只加入其余三種堿基，很大程度上增強突變型對應的峰高，提高質譜檢測的靈敏度。
[0057]在質譜檢測過程中，單堿基延伸產物在脫鹽純化后，點至含基質的靶片，并在真空環境中被激光激發，通過飛行管至檢測器。不同物質通過飛行管的時間與它們的分子量呈負相關，即分子量越大，飛行速度越慢，到達檢測器的時間越晚。)
術語“單堿基延伸”，又被 稱之為微測序(mini sequence)，指在體系中加入延伸引物和 ddNTP, ddNTP與延伸引物的3’端連接形成延伸產物(即引物延伸了一個堿基)，根據堿基互補配對原則，由SNP位點處基因型決定具體連接何種ddNTP，這個過程類似于PCR過程中 dNTP根據互補鏈的堿基組成，逐個添加到PCR引物上。由于“ddNTP”與普通dNTP不同的是，在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，不能同后續的ddNTP形成磷酸二酯鍵，因而，延伸引物僅在SNP位點處連接一個ddNTP，而不能像PCR那樣，不斷的往下延伸，因此稱之為單堿基延伸。單堿基延伸與測序過程非常相似，測序體系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物， 測序引物連接dNTP后將繼續延伸，只有連接ddNTP后，方終止延伸，因此測序產生的是長短不一的核苷酸片段的混合物；單堿基延伸體系中加入只有ddNTP，延伸引物只能連接一個 ddNTP,并終止延伸，因此單堿基延伸產生的是延伸引物僅延伸一個堿基的核苷酸片段。
[0058]術語“ddNTP”是一種修飾后的核苷酸，本技術方案共采用三種，它們之間存在分子量差異，ddATP、ddCTP、ddTTP 的分子量分別是 271.2Da、247.2Da、327.1Da，修飾后的 ddITP 的分子量比未修飾的大64.QlDa0當延伸引物根據突變位點的基因型而延伸不同的核苷酸， 將形成分子量差異。通過質譜檢測，可分辨出這種差異。例如，某突變位點若是C/T，對應的延伸引物長度為20個堿基(分子量6275.1Da)，當該突變位點處是T基因型，延伸引物將延伸一個A核苷酸并終止延伸，形成21個堿基長、分子量6546.3Da的延伸產物，當該突變位點處是C基因型，延伸引物不延伸，分子量6562.3Da處無延伸產物。即對該突變位點的該實驗方案，T基因型對應6546.3Da的質譜峰，C基因型對應6562.3Da的質譜峰。在實際檢測過程中，使用者可通過軟件對6275.1Da,6546.3Da、6562.3Da三處進行觀察:若6275.1Da 處出現質譜峰，則是有部分或全部延伸引物沒有與ddNTP結合；不論6275.1Da處是否出現質譜峰，若6546.3Da處出現質譜峰，則該突變位點的基因型為T，若6546.3Da 處質譜峰未出現，則說明沒有發生突變。
[0059]SNP:即單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。
[0060]SAP 酶:(即為 Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)蟲下喊性憐酸酶。
[0061 ]術語 12S、12R、12C、12D、12A、12V 分別是 Kras 基因 12 密碼子突變體 AGT、￡GT、IGT、 GAT, GCT, GlT的通俗叫法。
[0062]術語13D是Kras基因13密碼子突變體G^C的通俗叫法。
[0063]Taq酶:Taq酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus (Taq)中分離出的具有熱穩定性的DNA聚合酶。
[0064]術語“保護堿基”，指在PCR引物的5’端額外增加的堿基。由于保護堿基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反應剩余的PCR引物進入質譜檢測窗口， 以避免干擾檢測效果。此外，延伸引物的5’端也可以適量增加堿基序列，但其作用并非如同PCR引物的保護堿基，使其超出檢測窗口，而是適當調整延伸引物的分子量，使延伸引物及其產物在檢測窗口內處于一個合理的位置。例如，當兩個基因多態位點對應的延伸引物及產物的分子量接近時，通過給其中一個延伸引物增加堿基，改變引物及其產物的分子量， 與其他延伸引物及產物的分子量之間拉大差距，以避免局部區域質譜峰過于集中而產生干擾和分辨不清，從而提高檢測效果。因此，增加堿基后的延伸引物及產物的分子量，一定不會超出檢測窗口。上述延伸引物的額外堿基可稱為引物接頭。
[0065]堿性磷酸酶:其作用是降解PCR反應后體系中殘余dNTP，其原理是使dNTP的5’ -P 末端轉換成5’-OH末端，從而失去與引物結合使引物延伸的能力，避免了對下一步單堿基延伸的影響。
[0066]外切酶Exo1:其作用是從單鏈DNA的一端開始按序催化水解組成DNA的dNTP之間3，5-磷酸二酯鍵，使單鏈DNA最終水解為dNTP。在本技術方案中用于降解PCR反應后殘余的PCR引物。由于外切酶可以將單鏈的PCR引物切除，并不會在檢測窗口中出現，因此使用該外切酶時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。
[0067]術語“檢測產品”，指用于檢測SNP位點基因型的任何常規產品，包括:檢測試劑、 檢測芯片、檢測載體，以及檢測試劑盒等。 [0068]術語“純化”，指用于減少待檢體系內其他物質對后續反應的影響的處理步驟。本發明的PCR產物純化有兩種方式:一是分離雜質并丟棄，二是使雜質失去活性。其中，切膠純化、過純化柱等都是通過電泳、純化柱等分離雜質，并回收相對較純的PCR產物，可以認為是第一種純化方式，該方式一般耗時，操作復雜，特別是樣本量大時；堿性磷酸酶的作用是降解(亦稱“消化”)dNTP，使之不能繼續作為DNA聚合酶或單堿基延伸酶的底物參與PCR 或單堿基延伸反應，從而不干擾后續反應，可以認為是第二種純化方式。應當指出的是，單獨的外切酶ExoI不起純化作用，當它與堿性磷酸酶混合使用時，其作用是預先將單鏈DNA (在反應完成后的PCR產物體系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由堿性磷酸酶使 dNTP繼續降解。由于PCR引物被降解，不會進入最后的質譜檢測步驟，因此，如果計劃純化步驟中增加ExoI外切酶處理，那么無需使用具有保護堿基的PCR引物。此外，在單堿基延伸步驟之前，由于外切酶和堿性磷酸酶都通過高溫失活，其不會降解在單堿基延伸步驟中加入的單鏈的延伸引物、ddNTP等，因此避免對后續實驗產生影響。
[0069]術語“檢測窗口”，指可用于質譜檢測核苷酸分子量的范圍，通常涉及引物的設計參考范圍。其中，在設計延伸引物時，對于不同的SNP位點，根據這些位點所在DNA區域的序列特點，以及SNP位點的基因型，可以設計出分子量不同的延伸引物和延伸產物，避免不同延伸引物及產物之間由于分子量接近而存在干擾，從而可在一個相對寬闊的檢測窗口， 如4000-9000Da，實現對多個SNP位點的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0070]圖1為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對Kl 樣本的檢測結果。
[0071]圖2為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K2 樣本的檢測結果。
[0072]圖3為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K3 樣本的檢測結果。
[0073]圖4為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K4 樣本的檢測結果。
[0074]圖5為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K5 樣本的檢測結果。
[0075]圖6為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K6 樣本的檢測結果。
[0076]圖7為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K7樣本的檢測結果。
[0077]圖8為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K8 樣本的檢測結果。
[0078]圖9為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對K9 樣本的檢測結果。
[0079]圖10為實施例1中按照本發明所述的質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法中對KlO 樣本的檢測結果。
【具體實施方式】
[0080]為了進一步了解本發明的技術特征，下面結合具體實施例對本發明進行詳細地闡述。實施例只對本發明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本領域的技術人員在本發明的基礎上作出的任何非實質性的修改，都應屬于本發明的保護范圍。
[0081]實施例1
一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，包括如下步驟:
(1)PCR反應:游離DNA中Kras基因進行PCR擴增，得到含Kras基因12密碼子和13 密碼子區域的PCR產物；所述Kras基因是12和/或13密碼子發生突變的基因，所述PCR 擴增是用PCR引物I和/或PCR引物2進行擴增；
(2)PCR產物純化:對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，以減少對后續反應的干擾；
(3)單堿基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特異性的延伸引物，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與SNP位點處的基因型互補配對；所述特異性的延伸引物為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ；
(4)延伸產物純化:對步驟(3)得到的延伸產物進行純化；以獲得高純的延伸產物，避免鹽離子等雜質對后續檢測的影響；
(5)質譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行檢測。
[0082]在本實施例中，步驟(1)中所述游離DNA的提取:結直腸癌術后患者10例，采集靜脈血，分離血清(約 2ml),米用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen,貨號為55114)提取該患者血清中的游離DNA，編號K1-K10，-20°C備用。所述突變的基因名為 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D，所述 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D 基因序列分別為 AGT-GGC, CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-GAC,帶下劃線的為突變后的喊基。
[0083]在本實施例中， 用于PCR、PCR產物純化和單堿基延伸的組分如表1:
表1
【權利要求】
1.一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，包括以下步驟:(1)PCR反應:游離DNA中Kras基因進行PCR擴增，得到含Kras基因12密碼子和13 密碼子區域的PCR產物；所述PCR擴增是用序列為SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物進行擴增；(2)PCR產物純化:對步驟(1)得到的PCR產物進行純化；(3)單堿基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特異性的延伸引物，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與SNP位點處的基因型互補配對；所述特異性的延伸引物為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一條或幾條；(4)延伸產物純化:對步驟(3)得到的延伸產物進行純化；(5)質譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行檢測。
2.如權利要求1所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟(1)中所述 Kras 基因為 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D 中的任一種或幾種，所述 12S、12R、12C、12D、 12A、12V、13D 基因序列分別為 AGT-GGC、CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-GAC0
3.如權利要求1所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟(1)中所述引物I和引物2的5’端都增加3-15個保護堿基序列。
4.如權利要求3所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，所述引物I和引物2的5’端都增加的保護堿基序列為:ACGTTGGATG。
5.如權利要求1所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟(1)中所述 PCR 擴增是用 dNTPs、MgCl2 進行擴增，所述 dNTPs 為 dATP、dTTP、dGTP、dCTP。
6.如權利要求1所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟(1)中所述 PCR擴增是用Taq酶進行擴增。
7.如權利要求1所述質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟(1)中所述 PCR擴增經變性、退火、延伸三個步驟；所述變性溫度為95°C，所述退火溫度為56°C，所述延伸溫度為72°C。
8.一種鑒定血清中游離DNA的試劑盒，包括:(1)PCR反應試劑，包括:PCR引物、耐高溫的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反應緩沖液、 buffer ;所述 PCR 引物為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；(2)PCR產物純化試劑；(3)單堿基延伸反應試劑，包括:延伸引物、耐高溫的單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應緩沖液；所述耐高溫的單堿基延伸酶是iPLEX Pro酶；所述延伸引物為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5中的任一條或幾條。
9.如權利要求8所述的鑒定血清中游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述耐高溫的DNA 聚合酶為Taq酶。
10.如權利要求8所述的鑒定血清中游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應緩沖液為Tris-CL緩沖液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602740SQ201310585113
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】張學記, 馬慶偉, 張海燕, 林燕 申請人:毅新興業（北京）科技有限公司