用于空腸彎曲菌pcr-elisa檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法。本發明建立了空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒，本試劑盒根據空腸彎曲桿菌hipO基因保守區域設計了引物和探針。對比單純的PCR檢測，PCR-ELISA加入了雜交探針，使得此方法能夠準確檢測到樣品中目的基因片段，而不是單純檢測擴增產物分子量的大小，從而增加了檢測的特異性，使得此方法能夠準確鑒定樣品。本方法采用了鏈霉素-親和素-地高辛-抗地高辛抗體系統，對比單純的PCR和ELISA檢測，由于雙標記物的存在此檢測法在敏感性上有了提高；在結果的判定上，此法采用ELISA的顯色反應，使結果的判定更加直接。
【專利說明】用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的弓|物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法
【技術領域】
[0001]空腸彎曲桿菌(campylobacter jejuni)是近年來國內外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要引起人類發熱、急性腸炎、急性感染性多發性神經病，即格林巴利綜合征。該菌分布廣泛，多種動物上都分離到該菌，尤其是廣泛存在于家禽類動物的腸道中，雞的帶菌率占首位，次為豬。人類感染主要是由于空腸彎曲菌污染的食品、飲用水以及環境引起，根據美國疾病預防控制中心公布的美國食源性病原微生物導致疾病人數統計數據，空腸彎曲菌所導致的發病人數居第2位。因此國內外對空腸彎曲桿菌的監測都非常重視。
[0002]由于空腸彎曲桿菌培養條件苛刻，在25°C不生長，42°C生長良好，但容易進入VBNC狀態，使得常規的分離培養和生化鑒定耗時費力、靈敏度不高，所需時間長，而不利于爆發疫情時的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測所要求的快速、準確的原則。此外，在經典的空腸彎曲桿菌鑒定中，馬尿酸鹽水解實驗是區分空腸彎曲菌與其它彎曲菌的重要指標，但是這種表型鑒定準確性并不穩定。此項區分菌株的生化鑒定的主要缺點在于有時結果的一致性不好或存在個別的非典型菌株，可能會造成分離菌株的假陰性。近年來隨著分子生物學技術的發展，國內外已經先后開展了一些針對空腸彎曲菌的基因檢測研究，針對的靶基因主要包括16SrDNA、23SrDNA、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等。馬尿酸水解酶基因為空腸彎曲菌獨有的基因，因此可用于空腸彎曲桿菌的定性檢測。
[0003]目前，空腸彎曲桿菌的分子生物學方法以普通PCR和熒光定量PCR方法為主。普通PCR方法因其簡便快速，被廣泛應用于各病原體的檢測。但該方法電泳上樣個數受凝膠大小限制，不適于大量樣品的診斷，結果以對條帶的直觀觀察為準，影響敏感度。熒光定量PCR需要昂貴的儀器設備，而且檢測樣品費用能夠高，不能滿足大規模樣品檢測的要求。隨著人們對食品安全的高度重視，建立一種快速、準確、特異、靈敏的空腸彎曲菌檢測方法十分必要。
【發明內容】
[0004]本發明針對上述缺陷，目的在于提供一種具有靈敏度、特異性強、方便快捷的用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法。
[0005]為此本發明采用的技術方案是:所述上游引物和下游引物以及探針的核苷酸序列如下:
上游引物:hip0 F: 5’ -GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；
下游引物:hip0 R: 5’ -Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；
探針:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；
所述的下游引物5’端為生物素標記，探針的3’端為地高辛標記 。
[0006]本發明還包括有:PCR(DNA)模板、PCR反應液和ELISA反應液。
[0007]所述PCR (DNA)模板由增菌培養液培養而成。
[0008]所述PCR反應液包括PCR buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超純水。[0009]一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，按照以下步驟進行:
1)以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L, 37°C過夜，甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干；
2)以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200μ L/孔，37°C lh,同上法洗板3次，
3)以PBS將PCR產物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；
4)以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應lh，洗板5次；
5)加入100μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次；
6)加入100μ L臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH終止液； 7)可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調零，在405nm處測定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性；
生成PCR產物的反應步驟如下:
PCR 擴增反應體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L，反應條件:95°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環；72°C延伸5min。
[0010]所述模板的制備步驟如下:取0.5 mL增菌培養液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min,棄上清，加入100 μ L超純水，鏇潤混勻，100°C水浴20min,立即冰浴lOmin,12000r/min 離心 5min,取上清。
[0011]本發明的優點是:本發明建立了空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒，本試劑盒根據空腸彎曲桿菌hipO基因保守區域設計了引物和探針。對比單純的PCR檢測，PCR-ELISA加入了雜交探針，使得此方法能夠準確檢測到樣品中目的基因片段，而不是單純檢測擴增產物分子量的大小，從而增加了檢測的特異性，使得此方法能夠準確鑒定樣品。本方法采用了鏈霉素-親和素-地高辛-抗地高辛抗體系統，對比單純的PCR和ELISA檢測，由于雙標記物的存在此檢測法在敏感性上有了提高；在結果的判定上，此法采用ELISA的顯色反應，使結果的判定更加直接。
[0012]本發明所建立的檢測方法具有靈敏度、特異性強、方便快捷、使用范圍廣的優點。所需要的儀器為PCR儀和酶標儀，普通實驗室就有配置，試劑和耗材已有商品化的成品，容易購買，利于推廣。本發明在96孔酶標板中進行，成本低廉，適用于對空腸彎曲菌進行大規模、高通量的檢測。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實例進一步闡述本發明
如利用本發明空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測技術檢測20份家禽泄殖腔棉拭子。
[0014][1] PCR模板的制備將棉拭子置于含500ul滅菌PBS中，充分浸透20min，將浸液加至含9.5ml布氏肉湯的試管中，在微需氧條件下120rpm 42°C培養24h。取0.5 mL增菌培養液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min，棄上清，加入100 μ L超純水，漩渦混勻，100°C水浴20min，立即冰浴 lOmin, 12000r/min 離心 5min,取上清。
[0015][2] PCR 反應
PCR 擴增反應體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgC12 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、Taq酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L。反應條件:95°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環；72°C延伸5min。
[0016] [3] ELISA 反應
a以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L, 37°C過夜。甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干。
[0017]b以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200yL/孔，37°C lh，同上法洗板3次。
[0018]c以PBS將PCR產物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次。
[0019]d以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應lh，洗板5次。
[0020]e加入100 μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次。
[0021]f加入lOOyL臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50yL 2mol/L NaOH終止液。
[0022][4]結果檢測
可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調零，在405nm處測定各孔的吸光值，0D405nm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性。
【權利要求】
1.用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組和探針，其特征在于，所述上游引物和下游引物以及探針的核苷酸序列如下:上游引物:hipOF: 5’-GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；下游引物:hipOR: 5’-Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；探針:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；所述的下游引物5’端為生物素標記，探針的3’端為地高辛標記 。
2.一種含有權利要求1引物組和探針的檢測試劑盒，其特征在于，還包括有:PCR(DNA)模板、PCR反應液和ELISA反應液。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR(DNA)模板由增菌培養液培養而成。
4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括PCRbuffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超純水。
5.一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，按照以下步驟進行:1)以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L，37°C過夜，甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干；2)以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200yL/孔，37°Clh，同上法洗板3次；3)以PBS將PCR產物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；4)以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應lh，洗板5次；5)加入100μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次；6)加入100μ L臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH終止液；7)可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調零，在405nm處測定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性。
6.根據權利要求5所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，生成PCR產物的反應步驟如下:PCR 擴增反應體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L，反應條件:95°C預變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環；72°C延伸5min,各物料的用量可同比例放大或縮小。
7.根據權利要求6所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述模板的制備步驟如下:取0.5 mL增菌培養液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min，棄上清，加入100 μ L超純水，漩渦混勻，100°C水浴20min，立即冰浴lOmin，12000r/min離心5min,取上清，各物料的用量可同比例放大或縮小。
【文檔編號】C12N15/11GK103667454SQ201310585012
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】唐夢君, 高玉時, 陳大偉, 蒲俊華, 張小燕, 唐修君, 陸俊賢, 施祖灝, 葛慶聯, 顧榮 申請人:江蘇省家禽科學研究所, 唐夢君, 高玉時