一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速有效的綿羊肉和山羊肉的分子鑒別方法，包括以下步驟：提取待測樣品基因組DNA；采用上游引物：F5′-TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3′，下游引物：R5′-TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3′，以所提取的樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增；采用凝膠電泳對擴增產物進行鑒定。采用本發明的技術方案，能夠有效和可靠地鑒別綿羊肉和山羊肉，在食品安全、打擊假冒偽劣產品中具有廣范的應用。
【專利說明】一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法及其試劑盒
【技術領域】:
[0001]本發明屬于分子生物學檢測領域，涉及利用DNA分子標記技術鑒別綿羊肉和山羊肉的方法。
【背景技術】:
[0002]羊肉通常是綿羊肉和山羊肉的統稱，是我國傳統的食藥兩用、營養豐富的肉類食品，一直以來深受消費者的喜愛。綿羊肉和山羊肉都具有蛋白含量高、低脂肪和低膽固醇的特性，但兩者存在較大差異。山羊肉膻味重，膽固醇含量比綿羊肉低；綿羊肉比山羊肉脂肪含量高而口感細膩，膻味輕；中醫認為，山羊肉屬涼性，綿羊肉屬熱性，適合不同的人群食用。因此，受不同地區飲食習慣等因素的影響，消費者形成了對綿羊肉和山羊肉的選擇性消費，直接引起綿羊肉和山羊肉的價格差異。
[0003]近年來，受羊肉消費需求急劇上升、飼養成本增加等因素影響，我國羊肉價格顯著上漲。特別是市場流通的日益發達，羊肉經冷凍后再出售已是現代市場營銷的主要手段。由于羊肉冷凍后通過感官檢查很難區分其真假，一些不法商販以價格低廉的禽肉冒充，損害了消費者利益。傳統的感觀檢查和理化檢驗方法難以有效完成對綿羊肉和山羊肉的鑒別，也無法鑒別以禽肉假冒的冷凍羊肉，給當前的肉品監管工作提出了嚴峻挑戰。
[0004]PCR全稱聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。
[0005]凝膠電泳技術是分離、鑒定、純化DNA分子的常用方法。根據電泳中所用介質的不同，主要有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚合后的凝膠形成網狀結構，具有濃縮效應、電荷效應和分子篩效應，能夠有效分離不同分子量大小的DNA片斷。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段，采用水平裝置電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA效果較好，其分辯力極高，甚至相差Ibp的DNA片段都能分開，采用垂直裝置電泳。
[0006]在動物源類肉品的種屬鑒定方面，采用的遺傳標記主要來源于線粒體基因組(常用的包括細胞色素b基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因和控制區序列)，但未見應用基因組遺傳標記鑒別綿羊肉和山羊肉的報道。
【發明內容】
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[0007]本發明的目的是構建一種快速有效的綿羊肉和山羊肉的分子鑒別方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
[0008]本發明一方面涉及一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法，包括以下步驟:提取待測樣品基因組 DNA ；采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3丨，以所提取的樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增；采用凝膠電泳對擴增產物進行鑒定。[0009]在本發明的一個優選實施方式中，所述的提取待測樣品基因組DNA的方法為苯酹-氯仿法。[0010]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳。[0011]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的凝膠電泳還包括標準樣品的凝膠電泳，所述的標準樣品是綿羊肉和/或山羊肉相應基因的PCR擴增產物。[0012]本發明另一方面還涉及一種試劑盒，其包括上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。[0013]在本發明的一個優選實施方式中，所述試劑盒中任選包括DNA聚合酶，Taq酶。[0014]采用本發明的技術方案，能夠有效和可靠地鑒別綿羊肉和山羊肉，在食品安全、打擊假冒偽劣產品中具有廣范的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】:[0015]圖1:新鮮和冷凍肌肉樣品PCR擴增產物的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標準分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和IOObp ;泳道I為新鮮肉用山羊肉，泳道2為新鮮絨山羊肉，泳道3為新鮮奶山羊肉，泳道4為冷凍肉用山羊肉，泳道5為冷凍絨山羊肉，泳道6為冷凍奶山羊肉；泳道7為新鮮肉用綿羊肉，泳道8為新鮮毛用綿羊肉，泳道9為新鮮肉毛兼用綿羊肉，泳道10為冷凍肉用綿羊肉，泳道11為冷凍毛用綿羊肉，泳道12為冷凍肉毛兼用綿羊肉；泳道13為新鮮雞肉，泳道14為新鮮鴨肉，泳道15為新鮮鵝肉，泳道16為冷凍雞肉，泳道17為冷凍鴨肉，泳道18為冷凍鵝肉。[0016]圖2:新鮮羊肉樣本PCR擴增產物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標準分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I為新鮮肉用山羊肉，泳道2為新鮮絨山羊肉，泳道3為新鮮奶山羊肉；泳道4為新鮮肉用綿羊肉，泳道5為新鮮毛用綿羊肉，泳道6為新鮮肉毛兼用綿羊肉。[0017]圖3:冷凍羊肉樣本PCR擴增產物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標準分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I為冷凍肉用山羊肉，泳道2為冷凍絨山羊肉，泳道3為冷凍奶山羊肉；泳道4為冷凍肉用綿羊肉，泳道5為冷凍毛用綿羊肉，泳道6為冷凍肉毛兼用綿羊肉。[0018]圖4:綿羊和山羊混合DNA樣本PCR擴增產物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標準分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;泳道I為山羊，泳道2為綿羊，泳道3為綿羊與山羊DNA按1:1混合，泳道4為綿羊與山羊DNA按5:1混合，泳道5為綿羊與山羊DNA按10:1混合，泳道6為綿羊與山羊DNA按15:1混合，泳道7為綿羊與山羊DNA按1:5混合，泳道8為綿羊與山羊DNA按1: 10混合，泳道9為綿羊與山羊DNA按1: 15混合。
【具體實施方式】:[0019]實施例1:不同種屬來源肌肉樣品DNA提取、PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測[0020](一 )提取肌肉樣品基因組DNA[0021]采用常規的苯酚-氯仿法提取新鮮的或者冷凍的肌肉組織樣品基因組DNA。提取方法如下:
[0022]①組織樣品的處理
[0023]采集不同生產類型的綿羊和山羊肌肉樣本，綿羊包括肉用型(杜泊羊)、毛用型(中國美利奴羊)和肉毛兼用型(小尾寒羊)，山羊包括肉用型(波爾山羊)、絨用型(陜北白絨山羊)和奶用型(薩能奶山羊)。每種類型肌肉樣本分成兩部分，一部分_20°C直接冷凍，另一部分4°C保存。同時，采集新鮮和冷凍的雞、鴨、鵝肉樣本。切取新鮮的(或冷凍的)肌肉組織約0.5g，除去結締組織，用預冷至4°C的生理鹽水清洗；在冰浴中剪碎后，置于玻璃勻漿器，加入約2.0mL組織勻漿液勻漿至無明顯組織塊存在。
[0024]②細胞裂解
[0025]將勻漿后的組織液轉移至5ml離心管中，加入等體積的裂解緩沖液，再加入蛋白酶K溶液至終濃度200 u g/mL,混勻后55°C水浴中緩慢振蕩處理12h。
[0026]③酚/氯仿法抽提
[0027]裂解處理后的混合物中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合液，緩慢旋轉搖勻5min后4°C 10000r/min離心IOmin ;用寬口徑吸管謹慎地吸取上層水相，轉移至另一離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24:1),4°C 10000r/min離心lOmin。
[0028]④乙醇沉淀與洗滌`
[0029]用寬口徑吸管小心吸出上層含DNA的水相，轉移至離心管中，再向管中加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，上下倒置混勻。12000r/min離心IOmin,棄上清液；75%的預冷乙醇洗滌一次，12000r/min離心lOmin，棄上清液；用吸頭將管壁殘留的乙醇去除，室溫干燥15min (不要等DNA沉淀完全干燥，否則DNA不易溶解)。
[0030]⑤DNA溶解與保存
[0031]在盛有干燥DNA的離心管中加入適量TE緩沖液(100-200 y L)，4°C溶解。樣品DNA采用紫外分光光度計測定濃度后稀釋至IOOng/y L，_20°C保存備用。
[0032]( 二)引物設計、PCR擴增與檢測
[0033]根據綿羊角蛋白基因家族成員KRTAP1-4基因序列(GenBank序列號XO1610)設計一對PCR引物，上游引物為:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物為:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3;。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0034]以步驟(一)中提取的肌肉樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為 25 ii 1，包含 10XBuffer2.5u L, MgCl2 (25mmol/L) 2.0 y L，dNTPs (2.5mmol/L)2.0u L, lOpmol/L 上、下游引物各 1.0u L,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0.3 y L，IOOng/ u LDNA模板I U L，滅菌超純水15.2u L0擴增反應的條件為:94°C預變性3min ；94°C 45s，59 °C 45s，72°C 45s，34個循環后72°C延伸8min，4°C保存。
[0035]取2 ii L PCR擴增產物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中檢測有無特異性目標產物條帶。
[0036](三)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定
[0037]取檢測有特異性目標條帶的PCR擴增產物I U L在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳緩沖液為I X(20V/cm膠長度)電泳lh。
[0038]從膠板上取下凝膠,放入硝酸銀染色液(染色液含0.2% AgN03、I %冰醋酸和10%無水乙醇，現配現用。)中于搖床上染色20min，然后用蒸餾水漂洗2次，每次持續15s。
[0039]漂洗后的凝膠放入顯影液(含3%的無水NaOH，每200mL溶液臨用前加ImL甲醛，現配現用)在搖床上顯色約Smin (見到清晰的DNA條帶為止)，顯影后立刻用蒸餾水洗滌2次，每次持續15s。
[0040]將膠平鋪于燈箱上，凝膠成像系統拍照保存。根據條帶泳動位置反映出擴增產物的分子大小來鑒別肌肉樣品來源，山羊肌肉樣本的PCR擴增產物為630bp，綿羊肌肉樣本的擴增產物為600bp。在8%聚丙烯酰胺凝膠上，綿羊樣本的擴增產物由于比山羊樣本的擴增產物小30bp，泳動速度明顯快于山羊樣本的擴增產物。
[0041]1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，電泳圖譜如圖1所示。結果表明，所有的綿羊和山羊肌肉樣本中都能擴增出一條單一明亮的特異性條帶，而所有的雞、鴨、鵝肉樣本都未能擴增出條帶。
[0042]實施例2:綿羊和山羊肌肉樣本PCR擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定[0043]檢測有特異性目標條帶的綿羊和山羊肌肉樣本PCR擴增產物，取I U L在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染法顯帶，結果如圖2和圖3所示。
[0044]結果表明，綿羊和山羊肌肉樣本的PCR擴增產物在凝膠上表現為綿羊樣本的擴增產物泳動速度快于山羊樣本的擴增產物，說明兩者擴增產物的分子大小不同。
[0045]實施例3:混合羊肉DNA樣本的靈敏度分析
[0046]將綿羊和山羊的DNA樣品按不同質量比例混合后進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結果如圖4所不。
[0047]結果表明，當綿羊與山羊的DNA樣品按1:10、1:5、1:1、5:1和10:1混合時，能同時擴增出綿羊和山羊的特異性條帶；當綿羊與山羊的DNA樣品按1:15和15:1混合時，只能擴增出一種特異性條帶。說明當綿羊和山羊DNA混合樣品在10:1至1:10范圍內時，能檢測到兩種混合樣本；當綿羊和山羊DNA混合樣品中任何一種DNA達到和超過15:1時，就不能檢測到另一種DNA樣品的存在。
[0048]實施例4 =PCR擴增產物的測序驗證
[0049]以綿羊和山羊DNA為模板分別進行PCR擴增，擴增產物通過I %瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標條帶，以凝膠回收試劑盒純化目標片段后直接雙向測序。
[0050]測序結果表明，綿羊和山羊樣本的PCR擴增產物大小不同，綿羊的擴增產物為600bp (圖5)，山羊的擴增產物為630bp (圖6)，與凝膠電泳分離的結果相一致，驗證了應用本專利申請方法鑒別綿羊肉和山羊肉的有效性和可靠性。
[0051]應當理解的是，上述【具體實施方式】僅是例舉性說明，而不是對本發明的限制，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法，包括以下步驟: 提取待測樣品基因組DNA ； 采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3!，以所提取的樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增； 采用凝膠電泳對擴增產物進行鑒定。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的提取待測樣品基因組DNA的方法為苯酚-氯仿法。
3.根據權利要求1所述的方法，所述的凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳。
4.根據權利要求1所述的方法，所述的凝膠電泳還包括標準樣品的凝膠電泳，所述的標準樣品是綿羊肉和/或山羊肉相應基因的PCR擴增產物。
5.一種試劑盒，其包括上游引物:F5, -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，所述試劑盒中任選包括DNA聚合酶，Taq酶。
7.權利要求5或6 所述的試劑盒在鑒別綿羊肉和山羊肉中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614467SQ201310576876
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月9日 優先權日:2013年11月9日
【發明者】王蘭萍, 耿榮慶 申請人:王蘭萍