一種高效制備cd44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法

一種高效制備cd44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明具體公開了一種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）的方法。本發(fā)明首先利用TSA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）進(jìn)行預(yù)處理，然后再對(duì)MEF進(jìn)行誘導(dǎo)重編程，IPSC的效率可以隨著TSA的濃度升高而被提高。在挑取克隆前，將誘導(dǎo)后的MEF、未完全重編程、IPSC等細(xì)胞混合物，傳代接種到包被有基質(zhì)膠或基質(zhì)膜的培養(yǎng)板上，IPSC的細(xì)胞比例可以提高100倍，克隆挑取的成功率提高了13.84%，增加了277.8倍。為提高IPSC的效率提供了新思路和新方法。
【專利說(shuō)明】—種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，尤其是一種利用TSA對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，并且通過(guò)傳代選擇克隆從而提高誘導(dǎo)重編程效率和克隆培養(yǎng)成功率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)可以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞到干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，為再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療提供了更為豐富的研究資源和干細(xì)胞來(lái)源；IPSC細(xì)胞不僅可以極大地促進(jìn)疾病模型的制作，而且為極大地推動(dòng)著病人特異性細(xì)胞治療和藥物篩選技術(shù)的發(fā)展。基因缺陷性遺傳疾病，如地中海貧血(Thalassemia)、苯丙酮尿癥phenylketonuria, PKU)等單基因缺陷遺傳病，主要通過(guò)基因治療的方式，即將正常的基因?qū)胗腥毕莼虻幕颊呒?xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的缺陷基因進(jìn)行遺傳編輯，恢復(fù)缺失或者突變的基因，糾正致病基因，從根本上消除病患。
[0003]透明質(zhì)酸受體CD44分子是細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是一類重要的粘附分子，參與多種細(xì)胞生理功能，例如生長(zhǎng)、分化、遷移、感染等。CD44與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在臨床醫(yī)學(xué)研究中，CD44分子常常作為腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)分子標(biāo)志，用于分離前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌干細(xì)胞。CD44與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系十分復(fù)雜，可能影響了腫瘤細(xì)胞的粘附、運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)的降解等過(guò)程。例如，CD44分子在結(jié)腸癌干細(xì)胞的成瘤、致癌、轉(zhuǎn)移等方面具有重要的作用，共培養(yǎng)體系是基于transwell的培養(yǎng)體系，常用來(lái)研究某一類型細(xì)胞的分泌產(chǎn)物對(duì)另外一種細(xì)胞產(chǎn)生影響。在MSC與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞常常表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。因此，⑶44v mIPSC細(xì)胞的制作，為研`究⑶44分子對(duì)腫瘤遷移的影響，以及探索結(jié)腸癌等干細(xì)胞治療策略提供了良好的細(xì)胞材料來(lái)源。另外，臨床上CD44有可能成為新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，CD44分子表達(dá)水平與胰腺癌的耐藥特性有很大的關(guān)系，特異性⑶44 siRNA可顯著抑制K562/A02細(xì)胞CD44基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并有效逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥性。⑶44+mIPSC非常類似于腫瘤生長(zhǎng)、增殖模式，將為探索研究新型腫瘤抑制藥物提供藥物篩選的細(xì)胞模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了滿足新型腫瘤抑制藥物研究對(duì)細(xì)胞模型的需要，提供一種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
51.分離純化獲得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；
52.將⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞加入含有5~IOOnM曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24h ；
53.誘導(dǎo)CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程，獲得CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆。
[0006]為了描述方便，CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用CD44+MEF來(lái)表示；CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞用CD44—7 mIPSC來(lái)表示。
[0007]有報(bào)道顯示TSA能夠提高克隆胚胎的發(fā)育效率，但是不同研究中所使用的TSA濃度以及TSA處理時(shí)間不同，示認(rèn)為在體細(xì)胞克隆中使用TSA時(shí)，較高的TSA濃度可能會(huì)導(dǎo)致在豬等動(dòng)物中出現(xiàn)高致死率，造成胚胎異常發(fā)育。本文選用了 3個(gè)濃度的TSAji⑶44-/-MEF進(jìn)行了處理，處理24h后，細(xì)胞無(wú)明顯的形態(tài)變化，增殖速度也沒(méi)有明顯的改變。雖然不能夠顯著提高誘導(dǎo)重編程的效率，但是，隨著TSA濃度的增加，可以誘導(dǎo)重編程的細(xì)胞比例也隨之增加。提示，TSA有助于誘導(dǎo)重編程效率的提高，但是，TSA對(duì)重編程的貢獻(xiàn)可能還只能局限于卵母細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞核重編程。
[0008]優(yōu)選地，S2所述TSA在培養(yǎng)基中的濃度為ΙΟΟηΜ。
[0009]因?yàn)樯鲜霾襟ES3獲得CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆中包括誘導(dǎo)后的MEF、未完全重編程、IPSC等細(xì)胞混合物，所以，在挑選克隆過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)有一些不完全重編程的克隆被挑取，極大地影響克隆培養(yǎng)的工作效率。為了提高克隆培養(yǎng)的質(zhì)量，通常在誘導(dǎo)重編程后，挑取大量的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，在傳代過(guò)程中根據(jù)形態(tài)學(xué)對(duì)優(yōu)良的(完全重編程)IPSC進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)、鑒定。本文將初次誘導(dǎo)出來(lái)的IPSC進(jìn)行傳代，接種在無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)平板上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)IPSC克隆有著明顯的差異。由于無(wú)亂雜的體細(xì)胞的干擾，通過(guò)這種方式可以明顯地挑取到輪廓清晰、細(xì)胞致密、形態(tài)完好的IPSC克隆。傳代后，IPSC培養(yǎng)的成功率可以提高到~15%，不僅提高了 IPSC克隆的培養(yǎng)質(zhì)量，而且極大地減少了勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0010]優(yōu)選地，S3獲得的⑶44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆能通過(guò)傳代培養(yǎng)來(lái)提高陽(yáng)性克隆的挑取成功率；所述傳代培養(yǎng)為:將S3誘導(dǎo)獲得的CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆進(jìn)行消化、傳代一次，接種到基質(zhì)膠或基質(zhì)膜包被的培養(yǎng)板上，待克隆長(zhǎng)出后，挑選圓形或橢圓形、邊緣清晰、凸起良好的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述基質(zhì)膠或基質(zhì)膜為BD metrigel基質(zhì)膠或基質(zhì)膜；當(dāng)然，基質(zhì)膠或基質(zhì)膜也可以是本領(lǐng)域細(xì)胞培養(yǎng)中常規(guī)使用的其它類型的基質(zhì)膠或基質(zhì)膜。
[0011]更優(yōu)選地，所述用傳代方法提高誘導(dǎo)細(xì)胞重編程克隆挑取成功率的方法，包括如下步驟:
51.誘導(dǎo)13天的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Accutase消化處理后,繼續(xù)接種在預(yù)先鋪有BDmetrigel的培養(yǎng)板上，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；待克隆重新長(zhǎng)出時(shí)，挑取克?。?br> 52.挑取克隆時(shí)，細(xì)胞用PBS洗I次后，加入6mLPBS放在熱臺(tái)上；在體視鏡下，使用口吸針，將克隆轉(zhuǎn)移到0.2mL離心管中；每管加入0.05%胰酶10 μ L，消化2min后，加入10 μ L血清，吹散；接種到鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的明膠包被過(guò)的96孔板中，在KSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)；12h后換液。
[0012]具體地，SI所述分離純化獲得⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞包括如下步驟:
511.制作⑶44基因缺陷孕鼠；
512.取13.5天的孕鼠，處死后，分離純化胚胎；從胚胎中分離獲得成纖維細(xì)胞。
[0013]具體地，S3所述誘導(dǎo)⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程包括如下步驟: S31.包裝攜帶有0ct4、Klf4、Sox2 3種重編程因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒；S32.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；在體外培養(yǎng)10-15天，即可獲得CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
1、利用CD44基因缺陷型細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)重編程，不僅可以為研究癌癥發(fā)生提供新的細(xì)胞材料，并且可以為基因缺陷疾病的治療提供新的策略，為探究調(diào)控癌癥發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
[0015]2、用TSA對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，隨著TSA濃度的增加，可以誘導(dǎo)重編程的細(xì)胞比例也隨之增加。其中，5nM、50nM、IOOnM處理組的AP陽(yáng)性細(xì)胞的比例分別為(1.50 ± 0.042)%, (1.83 ± 0.02942) %、(2.007 ± 0.041)%。相比于對(duì)照組，TSA-1OOnM 處理組可以將誘導(dǎo)細(xì)胞重編程高效率提高0.074%
3、傳代后，AP陽(yáng)性細(xì)胞的比例已經(jīng)從~1%上升到~80%，提高了 100倍，有效地保證了克隆挑取的數(shù)量；IPSC培養(yǎng)的成功率可以提高到~15%，提高200多倍；不僅提高了 IPSC克隆的培養(yǎng)質(zhì)量，而且極大地減少了勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0016]說(shuō)明書附圖
圖1.本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。
[0017]圖2.⑶44+mIPSCs誘導(dǎo)結(jié)果及克隆培養(yǎng)；A、B攻毒24h后的明場(chǎng)、熒光照片；C攻毒第7天的⑶44-/-MEF聚集成一片；D、E攻毒第14天的⑶44-/-MEF，已經(jīng)有明顯隆起的克隆出現(xiàn)；F從DE挑取單克隆到96-feeder cell孔板的生長(zhǎng)狀況；G、H攻毒第14天的⑶44-/-MEF傳代到IOcm-BD metrigel上的培養(yǎng)第二天的生長(zhǎng)狀況；1從GH (IOcm-BDmetrigel)挑取單克隆到96-feeder cell孔板的生長(zhǎng)狀況。
[0018]圖3.CD44+mIPSCs 的 AP 染色結(jié)果。
[0019]圖4.CD44+miPSC 的 ICC 結(jié)果(0ct4、Nanog、SSEAl、DAPI )。
[0020]圖5.CD44-/-mIPSC 與 CD44-/-MEF 的多能基因表達(dá)水平；*# 表示 P〈0.001 ;** 表示 P〈0.01 ;* 代表 Ρ〈0.05。
[0021]圖6.畸胎瘤切片HE染色結(jié)果；(A)外胚層一上皮組織；(B)中胚層一一骨組織；(C)內(nèi)胚層----消化道。
[0022]圖7.CD44-/-mIPSC_Ell 的核型(oil, 10X10)。
[0023]圖8.在IOcm BD metrigel增多的細(xì)胞克隆。
[0024]圖9.在IOcm BD metrigel增多的AP陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
[0025]圖10.從IOcm BD metrigel挑取的AP陽(yáng)性細(xì)胞克隆再培養(yǎng)時(shí)形成克隆能力比較。
[0026]圖11.TSA處理供體細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程效果；(A)誘導(dǎo)第10天克隆數(shù)量；(B)誘導(dǎo)13天后，對(duì)AP陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0028]實(shí)施例1 一、材料
CD44基因缺陷小鼠:購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(貨號(hào)005085)；L-維生素C 二磷酸三鈉(貨號(hào)49752，Sigma)；
Knockout DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自Life Technologies公司；試劑購(gòu)自sigma公司;抗體購(gòu)自eBioscience公司;質(zhì)粒pMXs_0ct4 (O,攜帶有小鼠0ct4基因序列，genebank:NM_013633)、pMXs-Klf4 (K，攜帶有小鼠 Klf4 基因序列，genebank:ΝΜ_010637)、pMXs_Sox2(S，攜帶有小鼠Sox2基因序列，genebank:NM_011443)為中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物遺傳
工程實(shí)驗(yàn)室保藏。
[0029]二、試驗(yàn)步驟:本實(shí)施例的整個(gè)流程示意圖如圖1所示。
[0030]S1.分離純化得到⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(⑶44+MEF細(xì)胞)。 [0031]Sll.分離小鼠胚胎:制作⑶44基因缺陷孕鼠，見陰道栓時(shí)，算受孕0.5天；取13.5天的孕鼠，在中山大學(xué)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)指導(dǎo)下處死，無(wú)菌取出胎兒；剝離胎盤組織，用含有抗生素的PBS洗2次；用剪刀、眼科鑷子取出頭、四肢、尾巴、內(nèi)臟等，軀干組織剪碎后，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；1600rpm,離心5min,棄上清,收集下層細(xì)胞；
S12.分離純化MEF細(xì)胞:將下層細(xì)胞用5mL胰酶重懸后，再加入2μ L DNasel，將混合液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中；37°C條件下孵育30min ;加7mL含有10%血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；1600rpm，離心5min，棄上清；沉淀用培養(yǎng)液重懸后，取上層細(xì)胞懸液，用40 μ m細(xì)胞篩過(guò)濾后；計(jì)數(shù)，按5X IO6個(gè)細(xì)胞接種到I個(gè)IOcm培養(yǎng)皿中，放置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后換液，大約2天長(zhǎng)滿即得⑶細(xì)胞。
[0032]S2.TSA處理MEF細(xì)胞:將步驟S12獲得的⑶細(xì)胞傳代后，將獲得的OMflffiF細(xì)胞(P 1~P2)接種到24孔板中，每孔大約IO4個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)12h后，細(xì)胞用PBS洗2次；加入含有不同濃度TSA (TSA在培養(yǎng)基中的濃度分別為5nM、50nM、IOOnM)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后用PBS洗I次；再進(jìn)行誘導(dǎo)重編程處理；同時(shí)用不經(jīng)過(guò)TSA處理的MEF細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)重編程，作為對(duì)照。
[0033]S3.誘導(dǎo)⑶44+MEF細(xì)胞重編程
S31.逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝:提取pMXs-0ct4、pMXs-Klf4和pMXs_Sox2質(zhì)粒，將pMXs-0ct4、pMXs-Klf4、pMXs-Sox2質(zhì)粒進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素處理后；將其濃度濃縮到I μ g/μ L ;
將40 μ L lipo2000加入到ImL Opt1-MEM中，輕柔混勻，記作A液；將pMXs_0ct4、pMXs-Klf4、pMXs-Sox2質(zhì)粒各10 μ g加入到ImL Opt1-ΜΕΜ中，輕柔混勻，記作B液；室溫放置5min后；將B液加入A液中，輕柔吹打40下；室溫放置30min ；
Plat-E細(xì)胞生長(zhǎng)到70%覆蓋度時(shí)，PBS洗2次，加入5mL新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)30min后，將混勻的A+B液滴入培養(yǎng)液中，輕輕混勻；繼續(xù)培養(yǎng)；收集24h、48h、72h時(shí)的培養(yǎng)液，
0.45 μ m濾器過(guò)濾后，即為新鮮的病毒液。
[0034]S32.誘導(dǎo)重編程過(guò)程:⑶44+MEF細(xì)胞達(dá)到70%匯合度后，PBS洗2次，加入新鮮的病毒液(含有polybrane,終濃度8 μ g/mL),室溫放置30min后,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；12h后，換液(培養(yǎng)液為10%血清培養(yǎng)基添加終濃度為50 μ g/mL的Vc);繼續(xù)培養(yǎng)12h后，在進(jìn)行病毒感染一次；12h后,換液(培養(yǎng)液為一半體積的含有Vc的10%血清培養(yǎng)基,一半體積的干細(xì)胞培養(yǎng)基)；之后，使用干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天換液，繼續(xù)培養(yǎng)到13天。
[0035]S33.1PSCs克隆的挑取
第13天誘導(dǎo)的⑶44+MEF上出現(xiàn)了明顯的克隆，即為⑶44+IPSCs ;將這些細(xì)胞用PBS洗2次，利用0.25%的胰酶消化后，接種到IOcm包被有BD metrigel的培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)；第3天后，培養(yǎng)班上出現(xiàn)明顯的克隆；
移去培養(yǎng)基，PBS洗I次，加入6mL PBS放在熱臺(tái)上；在體視鏡下，使用口吸針，將單個(gè)克隆分別轉(zhuǎn)移到0.2mL離心管中；每管加入0.05%胰酶10 μ L，消化2min后，加入10 μ L血清，吹散；接種到鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的明膠包被過(guò)的96孔板中，在KSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)；12h后換液。
[0036]S34.CD44+IPSCs克隆的傳代培養(yǎng)
克隆需要傳代時(shí)，用PBS洗2次后，加入消化酶Accutase，2min后，加入KSR培養(yǎng)液吹散，轉(zhuǎn)移到離心管中，2000rpm離心5min ;細(xì)胞重新1:5~1:10接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上,或者明膠、BD metrigel包被的培養(yǎng)板中。
[0037]S4.CD44+IPSCs 的鑒定 S41.AP染色及AP-1ive染色
AP染色:細(xì)胞用PBS洗2次后，4%多聚甲醛溶液固定IOmin ；PBS洗3次，每次5min ;按照說(shuō)試劑明書配制染色工作液，輕輕加入細(xì)胞中，避光室溫下孵育30min ;待細(xì)胞有顏色變化時(shí)，棄掉染色液，用PBS洗2次，每次5min ;拍照觀察；
AP-1ive染色:根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用01^1^12稀釋500父的貯存液；細(xì)胞用DMEM-F12洗2次后，加入AP-1ive染色液，放入培養(yǎng)箱孵育30min ；PBS洗3次后拍照觀察。
[0038]S42.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)
吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，每次5min ;加入4%的多聚甲醛溶液，室溫固定30min ；PBS清洗3次，每次5min ;加入0.5% TritonX-1OO室溫孵育30min ；PBS清洗3次，每次5min ;加入1% BSA/PBS室溫封閉Ih ;加入稀釋的一抗，溫室孵育2小時(shí)或者4°C過(guò)夜；PBS清洗3次，每次5min ;加入稀釋的二抗，溫室避光孵育Ih ；PBS清洗3次，每次5min ；加入5Pg/mL的DAPI避光染色5分鐘；PBS洗2次，每次5min ;熒光顯微鏡下觀察，拍照。
[0039]S43.畸胎瘤的制作及染色
消化CD44+IPSCS，制成單細(xì)胞懸液，加入DMEM使細(xì)胞密度在5 X IO6個(gè)/150μ?左右；把150-200μ?細(xì)胞懸液注射到裸鼠后腿內(nèi)側(cè)皮下；30天后手術(shù)法取出畸胎瘤并進(jìn)行HE染色，
S44.染色質(zhì)核型分析
將⑶44+IPSCs在體外培養(yǎng)24~48h后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.05 μ g/mL的秋水仙胺處理1.5h ；PBS洗I次，0.25% Tyrisin-EDTA消化至克隆松散，加入2.5mL的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，將克隆充分吹打成單細(xì)胞；2000rpm離心5min,棄上清，向細(xì)胞中加入IOmL低滲液(0.075M KCl )，用力吹打100次以上，靜置30min ;加入3滴_20°C預(yù)冷的新鮮配制的固定液(甲醇:冰醋酸，3:1),顛倒混勻后靜置5min后,2000rpm離心5min,棄上清；向細(xì)胞中加入IOmL固定液，輕柔吹打混勻后靜置30min，2000rpm離心5min，去上清，保留ImL上清，輕輕拍打懸起，緩慢加入固定液，邊加邊振蕩，直至滿管；如此重復(fù)3次；用0.5~lmL左右的固定液將細(xì)胞重懸，吹打均勻后滴:1-4滴懸液至清洗干凈并-20°C預(yù)冷的載玻片上；30°傾角放置載玻片，室溫晾干；加一滴Gimesa染液染色10分鐘，到顯微鏡下觀察染色體；
S45.定量PCR 鑒定 CD44+IPSCS
細(xì)胞用PBS洗2次后，加入TriZol試劑處理2min，提取總mRNA ;使用Olig0 dT引物對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后；使用LightCycler 480儀器對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。[0040]三、結(jié)果分析:
克隆形態(tài)=CDAfAlPSCs在誘導(dǎo)后，細(xì)胞由成纖維狀變成了圓形、橢圓形、隆起的、邊緣清晰的、細(xì)胞緊密的克隆，如圖2。
[0041]AP染色:誘導(dǎo)得到的⑶44+IPSCs經(jīng)過(guò)AP染色后，克隆具有較高的AP活性，如圖3。
[0042]干細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá):誘導(dǎo)得到的⑶44丨IPSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志分子0ct4、SSEAl、Nanog 等，如圖 4。
[0043]多潛能基因表達(dá)水平:誘導(dǎo)得到的CD44+IPSCS表達(dá)多潛能基因0ct4、Sox2、Nanog等，與誘導(dǎo)前的CD44+MEF比較，差異極顯著，(P<0.01 / P<0.001)如圖5。
[0044]畸胎瘤:誘導(dǎo)得到的⑶44+IPSCs在體內(nèi)可以形成畸胎瘤，并且可以分化形成3胚層的組織，如 圖6。
[0045]染色體核型:誘導(dǎo)得到的⑶44+IPSCs具有完整的染色體數(shù)目，核型無(wú)明顯的異常，如圖7。
[0046]TSA處理對(duì)重編程效率的影響:與未經(jīng)TSA處理組相比，經(jīng)過(guò)TSA處理的細(xì)胞，在誘導(dǎo)第10天時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞變?yōu)閳A形、聚集明顯，并且具有極高的AP活性；在第10天時(shí)，出現(xiàn)的細(xì)胞聚集的集落數(shù)，濃度為50nM的實(shí)驗(yàn)組最高，但是3種濃度之間并無(wú)顯著性差異；在誘導(dǎo)第13天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果如圖11，細(xì)胞的AP陽(yáng)性比例隨著TSA濃度的增加而提高；100nM處理后，AP陽(yáng)性細(xì)胞比例最高，盡管和未處理組無(wú)顯著性差異，但是，比未處理組提高了 0.074%。
[0047]傳代處理對(duì)克隆挑取成功率的影響:誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代接種到BD metrigel包被的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)后，克隆的數(shù)目明顯增多，尤其是圓形、橢圓形、隆起的、邊緣清晰的、細(xì)胞緊密的克隆數(shù)目明顯增多，極大便利了多克隆的挑選，如圖8 ；AP陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著提高，如圖9 ;對(duì)挑選的克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)傳代處理后，克隆的挑取、培養(yǎng)成功率提高了 200多倍。
[0048]綜合以上結(jié)果，本專利發(fā)展了一種制作和鑒定⑶44v mIPSC的方法，并且使用TSA提高了誘導(dǎo)重編程效率，利用傳代的方法提高了克隆的挑取培養(yǎng)成功率，為腫瘤發(fā)生機(jī)制研究、抗癌藥物篩選提供了干細(xì)胞材料。
【權(quán)利要求】
1.一種高效制備CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.分離純化獲得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞； 52.將CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞加入含有5~IOOnM曲古抑菌素A的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h ； 53.誘導(dǎo)CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程，獲得CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S3獲得的CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆能通過(guò)傳代培養(yǎng)來(lái)提高陽(yáng)性克隆的挑取成功率；所述傳代培養(yǎng)為:將S3誘導(dǎo)獲得的CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆進(jìn)行消化、傳代一次后，接種到基質(zhì)膠或基質(zhì)膜包被的培養(yǎng)板上，待克隆長(zhǎng)出后，挑選圓形或橢圓形、邊緣清晰、凸起良好的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述基質(zhì)膠或基質(zhì)膜為BDmetrigel基質(zhì)膠或基質(zhì)月吳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S2所述曲古抑菌素A在培養(yǎng)基中的濃度為ΙΟΟηΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，SI所述分離純化獲得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞包括如下步驟:` 511.制作⑶44基因缺陷孕鼠； 512.取13.5天的孕鼠，處死后，分離純化胚胎；從胚胎中分離獲得成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，S3所述誘導(dǎo)CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程包括如下步驟: `531.包裝攜帶有0ct4、Klf4、Sox23種重編程因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒； `532.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD44基因缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；在體外培養(yǎng)10-15天，即可獲得CD44基因缺陷小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103695469SQ201310558490
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】宋振威, 冀倩倩, 趙海靜, 聶宇, 叢佩清, 陳瑤生 申請(qǐng)人:中山大學(xué)