抗冠狀病毒藥物高通量篩選方法

抗冠狀病毒藥物高通量篩選方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗冠狀病毒藥物高通量篩選方法，該方法的建立是基于酵母遺傳系統的構建。即冠狀病毒的N7甲基轉移酶能互補酵母菌株N7甲基轉移酶的功能，使得其能在含有5-FOA的篩選培養基上生長。利用該系統可以篩選特異性抑制冠狀病毒N7甲基轉移酶活性的藥物庫，它具有快速、直接的特點，在篩選過程中可以排除對宿主N7甲基轉移酶的影響，克服了傳統抗病毒藥物篩選系統篩選出的抑制劑對宿主本身的副作用；并且該系統應用96或者384微孔板作為篩選工具，使抗病毒藥物篩選實現了高通量型；最重要的是利用該系統篩選出的藥物分子對于抗冠狀病毒具有專一性，具有十分重要的應用價值。
【專利說明】抗冠狀病毒藥物高通量篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學、病毒學、生物化學和生物醫藥技術研究領域。特別是涉及以冠狀病毒N7甲基轉移酶能互補酵母遺傳系統細胞生長為基礎，而建立的一種抗冠狀病毒藥物高通量篩選平臺。 【背景技術】
[0002]冠狀病毒感染可以造成包括人在內的多種動物的致病，造成急性和慢性呼吸道、腸道及中樞神經系統疾病。引起的人類疾病主要是以發熱、干咳、胸悶為主要癥狀的呼吸系統感染(包括嚴重急性呼吸綜合征，Severe Acute Respiratory Syndromes,簡稱SARS)(Rota et al., 2003);還可引起嬰兒和新生兒急性腸胃炎；另外，冠狀病毒也是成人普通感冒的主要病原之一。目前，中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus (MERS-CoV))于2012年夏天爆發，截至2013年5月14日，被新型冠狀病毒感染的患者中有53%已經死亡，高致死率造成了嚴重的社會恐慌和經濟損失(Cauchemez etal., 2013;de Groot et al., 2013;de Wilde et al.，2013)。截止目前，針對冠狀病毒仍無有效的疫苗或者特異性治療方法，且冠狀病毒的廣泛存在和高重組率易發生新發野生型病毒，因而是全世界面臨的主要健康威脅之一，使得人們不得不通過各種病毒抑制劑篩選方法找尋適當的藥物分子(Stockman et al.，2006)。
[0003]控制SARS冠狀病毒及新發冠狀病毒爆發以及傳播的最有力手段，就是開發一種有效的抗病毒方法。目前主要的手段包括:開發失活的SARS冠狀病毒疫苗、重組亞單位疫苗、以DNA為基礎的重組疫苗和以病毒為載體的重組疫苗(Roberts et al.，2008);開發抑制SARS-CoV與宿主受體結合(Sainz et al.，2006)、進而抑制SARS-CoV進入宿主細胞(Lang et al.,2011)的藥物；開發抑制SARS-CoV的復制及轉錄的藥物(如靶向病毒蛋白酶或其他復制轉錄酶的藥物)(Ghosh et al., 2009)和抑制SARS-CoV的組裝、出芽及釋放的藥物。但目前均未有進入臨床應用的成果。
[0004]高等真核生物細胞信使RNA (mRNA) (Shatkin, 1976; Shimotohno etal., 1977; Shuman, 2001)及大部分病毒RNA的5’ -端均具有N7甲基化修飾的帽子結構。同時，5’端的帽子修飾具有很多重要的生物學功能:保護信使RNA避免被5’外切酶降解(Schwer et al.，1998);指導前體信使RNA的剪切及核輸出(Lewis andIzaurralde, 1997);保證信使 RNA 的穩定性及有效的翻譯(Baner jee, 1980; Furuichi andShatkin, 2000;Muthukrishnan et al.，1975)。除此以外，病毒RNA的帽子結構已被證明可以幫助冠狀病毒逃避宿主細胞內免疫因子MDA5 (melanoma differentiation-associatedgene5)的識別(Zust et al., 2011)及干擾素誘導蛋白 IFITCIFN-1nduced proteins withtetratricopeptide repeats)介導的免疫抑制(Daffis et al.，2010)。由于病毒本身的加帽機制與宿主細胞內信使RNA的加帽存在差別，使病毒加帽酶作為抗病毒藥物靶標成為可能(Bouvet et al., 2010; Dong et al., 2008; Ke et al.，2012)。目前一些抑制病毒加帽系統的廣譜藥物，如AdoHcy、Sinfungin, ATA等可以抑制冠狀病毒的甲基轉移酶的活性(Bouvet et al.，2010)。但是這些非特異性的抑制冠狀病毒甲基轉移酶的藥物對宿主本身造成較大的副作用。因此，開發一種能夠快速、有效，且在篩選過程中能準確評估藥物對宿主本身加帽系統影響的冠狀病毒藥物抑制篩選平臺極為重要。具有較大的應用價值。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種基于酵母遺傳系統的抗冠狀病毒藥物高通量篩選方法。
[0006]為實現上述目的，本發明首先提供一種用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的細胞株，其包括表達人N7甲基轉移酶但自身N7甲基轉移酶缺失的酵母，以及表達冠狀病毒的非結構蛋白14但自身N7甲基轉移酶缺失的酵母。
[0007]上述用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的細胞株，其中冠狀病毒為SARS(SevereAcute Respiratory Syndrome) ；MERS-CoV(Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus);MHV(murine hepatitis virus) ；TGEV(Transmissible gastroenteritisvirus of swine)或IBV(infectious bronchitis virus)。
[0008]上述用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的細胞株，其中所述酵母含有質粒:pMceK294A-SARS-CoV-nspl4、pMceK294A-MERS-CoV_nspl4、pMceK294A-MHV-CoV_nspl4、pMceK29 4A-TGEV-CoV-nspl4 或 pMceK294A-1 BV-CoV_nspI 4。 質粒pMceK294A-SARS-CoV-nspl4是指克隆有SARS病毒非結構蛋白nspl4的pMceK294A質粒，其他類似。
[0009]本發明抗冠狀病毒藥物高通量篩選的方法，是將上述的細胞株在Trp-營養缺陷的培養基上培養，加入待選藥物，通過考察藥`物對不同轉基因的酵母抑制率，篩選藥物。所述的Trp-營養缺陷的培養基為Trp-營養缺陷的SD液體培養基。
[0010]具體地，本發明方法是將經5-F0A篩選平板上生長的上述的細胞株接種于Trp-營養缺陷的SD液體培養基中，然后加入各種不同濃度的測試藥物，通過反應酵母細胞生長數目的吸光值法來確定藥物對表達不同種屬N7甲基轉移酶蛋白的酵母菌株生長的抑制情況，于30°C條件下搖菌培養，藥物作用20小時以后測定酵母菌株的生長情況，從而用于篩選能夠抑制酵母菌生長的藥物及其濃度。
[0011]本發明以利用酵母菌功能互補遺傳體系(冠狀病毒的非結構蛋白14(nspl4)轉化到N7甲基轉移酶缺失的釀酒酵母菌YBS40 (S.cerevisiae strain YBS40)，若它們能夠互補酵母菌RNA鳥嘌呤-N7甲基轉移酶的功能則能在含有5-F0A培養基上生長)為設計的理論基礎。轉化不同組的冠狀病毒nspl4，發現所有的冠狀病毒nspl4都能互補酵母菌YBS40的生長，說明它們均具有N7甲基轉移酶的功能(圖LA)，因此該篩選系統對于冠狀病毒有較廣泛的適用性。將分別表達酵母菌本身、人類和SARS-CoV (或其他冠狀病毒)的N7甲基轉移酶的YBS40酵母菌接種到液體培養基中，分別用細胞直接計數法和分光光度計法測定酵母細胞的數目，最終發現分光光度計法在酵母菌的生長對數期可以如實反映酵母的細胞數目，為高通量、快速篩選抑制冠狀病毒甲基轉移酶的抑制劑提供了保證(圖1.B)。將上述表達不同種屬N7甲基轉移酶的YBS40酵母菌分別接種于96 (圖3、圖4)或384微孔板(圖6)，加入已經證實對所有N7甲基轉移酶具有廣譜抑制作用的藥物，發現我們建立的篩選平臺十分有效。目前已經成功應用于大規模篩選天然化合物提取物藥物庫和小分子化合物庫，以期望篩選得到對人類N7甲基轉移酶沒有影響，但對冠狀病毒N7甲基轉移酶具有特異性抑制效果的藥物(表1)。
[0012]1.驗證冠狀病毒非結構蛋白14具有N7甲基轉移酶的功能
[0013]在這個篩選系統中，YBS40菌株染色體上ABDl基因被敲除后成為致死表型，穩定表達一個帶有URA3篩選標記的質粒，其上含有ABDl基因，以此互補YBS40的生長。同時，URA3能編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶，這種酶在嘧啶合成的一些步驟中起催化作用。當5-F0A加入培養基平板上以后，酵母細胞吸收此種藥物，在URA3編碼的脫羧酶作用下轉化成有毒的化合物5-氟尿嘧啶。因此，只有不攜帶URA3基因的突變株能在含有5-F0A的培養基上生長。所以說當用5-F0A篩選時，YBS40中帶URA3的互補質粒丟失，伴隨著的ABDl互補基因也就丟失，那么酵母又變為致死表型。只有當被轉化的質粒上帶有能互補酵母甲基轉移酶的基因時，才能使YBS40在含5-F0A的培養基上生長。結果顯示，冠狀病毒不同組的nspl4蛋白都能夠互補酵母菌YBS40的生長，說明它們均具有N7甲基轉移酶的功能(圖LA)。因此該系統可以用來篩選針對不同冠狀病毒的N7甲基轉移酶抑制劑。
[0014]2.以酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺的建立
[0015]將表達不同種屬N7甲基轉移酶(S.cerevisiae (MT-Yeast)、人(MT-Human)和SAR-CoV (MT-SARS))的YBS40酵母菌分別接種于液體培養基中培養，用分光光度計法(圖1.B)與細胞直接計數法(圖1.C)兩種方法分別測定酵母細胞的生長情況，發現在酵母的生長對數期分光光度計法能如實地反應酵母細胞的數目(圖1.D)，為直接用吸光值法測定藥物抑制酵母菌生長的篩選系統提供了理論依據，使得我們建立的酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺實現大規模性成為可能。
[0016]3.對酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺進行驗證和優化`
[0017]在體外原核表達、純化不同組冠狀病毒的N7甲基轉移酶(N7_MTase)蛋白(nspl4),然后經生化檢測不同藥物作用下對其N7_MTase活性的影響，發現AdoHcy、ATA和Sinefungin對所有測試的冠狀病毒N7_MTase均具有抑制作用(圖2.A)。將這些經體外實驗驗證有效的藥物應用于我們建立的酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7_MTase抑制劑篩選平臺中(96微孔板作為篩選工具)，發現僅僅Sinefungin (100 μ Μ)具有抑制效果，且Sinefungin是一種廣譜的N7_MTase抑制劑，對酵母、人類及冠狀病毒的N7_MTase活性都有廣譜的抑制作用(圖3)。為了進一步驗證建立的冠狀病毒抑制劑篩選系統的有效性，在Sinefungin (0.1 μ M)低濃度作用下觀察藥物對冠狀病毒N7_MTase活性的影響,發現低濃度條件下Sinefungin對酵母N7_MTase具有明顯抑制作用，對人類其次，而對冠狀病毒抑制作用最弱(圖4)。說明該篩選平臺能夠有效的驗證各種抑制的在體內的真是抑制效果，并對潛在藥物的抑制效果作出評價。
[0018]針對酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺可以應用于藥物庫的大規模篩選，以期找到特異性的抗冠狀病毒藥物。因此，我們將在96微孔板中運行正常的篩選系統應用到384微孔板中，經測試發現在384微孔板中，表達不同種屬N7甲基轉移酶的YBS40酵母細胞生長更為穩定，且在酵母細胞的生長對數期分光光度計法更能精確地反應細胞數目(圖5.Α,Β, C)。利用Sinefungin作為測試藥物,經驗證發現384微孔板作為篩選工具的抗冠狀病毒藥物高通量篩選平臺運行正常(圖5.D，E)。[0019]本發明在酵母菌功能互補遺傳系統之上構建了抑制酵母細胞生長的冠狀病毒加帽抑制劑篩選平臺。該平臺以96、384微孔板作為篩選工具，通過吸光值法直接測定表達冠狀病毒非結構蛋白14 (Coronavirus nspl4) N7甲基轉移酶(N7-methyltransferase, N7_MTase)酵母的生長狀況,具備了高通量藥物篩選的能力。總之，本研究為大規模篩選冠狀病毒加帽酶抑制劑提供了良好的平臺:384微孔板作為篩選工具，使得藥物耗費量大大減少，節省了成本；僅僅利用分光光度法測定藥物對酵母細胞生長的抑制效果，實現了篩選的方便、快捷及直接性。
【專利附圖】

【附圖說明】[0020]圖1以酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選系統的建立。
[0021](A)將 pMceK294A 空載體、人類 N7 甲基轉移酶(N7-MTase)、SARS-CoVN7-MTase(SARS-CoV nsp 14)、MHV-CoV N7-MTase (MHV-CoV nsp 14)、IBV-CoVN7-MTase (IBV-CoV nsp 14)及 TGEV-CoV N7_MTase (TGEV-CoV nsp 14)轉化到釀酒酵母
S.cerevisiae N7_MTase缺失的釀酒酵母菌YBS40中，涂布于5-F0A上進行篩選；(B)轉化pMceK294A空載體的酵母菌株在96孔板中培養，用分光光度計法測定的生長曲線。每個時間點樣品都設有三個重復。(C)用細胞直接計數法測定的酵母生長曲線。每個時間點樣品都設有三個重復。(D) (E) (F)分別為分光光度計及細胞直接計數兩種方法測得的MT-Yeast、MT-Human和MT-SARS酵母細胞生長數據，繪制XY散點圖，以0D595值為橫坐標，直接計數法測定的細胞數量為縱坐標，利用最小二乘法繪出兩者的回歸曲線。
[0022]圖2.體外生化檢測藥物對冠狀病毒N7甲基轉移酶的影響。
[0023](A) 200nM原核表達純化的冠狀病毒Nsp 14與底物分子GpppA作用，經filter-binding assay,檢測冠狀病毒nspl4蛋白是否均具有N7甲基轉移酶活性。同時在反應體系中加入終濃度為100 μ M的藥物，測定不同藥物對冠狀病毒nspl4表達的N7甲基轉移酶活性的影響。圖中1:陰性對照:1%DMS0 ；2:AdoHcy ；3:ATA ；4: sinefungin ；5:ribavirin。從左到右柱子分別代表SARS、MHV、IBV和TGEV nspl4蛋白.(B)劑量依賴曲線及SIN對SARS-CoV甲基轉移酶活性抑制的IC50值(每個實驗組都設置有三個重復)。
[0024]圖3.以酵母細胞為基礎的N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺有效性的驗證。
[0025](A)測試終濃度為 100 μ M 的 AdoHcy, ATA, Ribavirin, and Sinefungin,對表達酵母本身N7甲基轉移酶的YBS40菌(MT-Yeast)生長的影響。藍色MOCK陰性對照；紅色AdoHcy;黃色ATA;紫色Ribavirin;綠色Sinefungin.⑶測試上述四種藥物對表達人N7甲基轉移酶的YBS40菌株(MT-Human)的影響。(C)測試上訴四種藥物對表達SARS-CoV的N7甲基轉移酶的酵母菌(MT-SARS)生長的影響。
[0026]圖4.Sinefungin對酵母體內表達的、所有冠狀病毒屬N7甲基轉移酶活性的影響。
[0027](A)測試終濃度為0.1 μ M的Sinefungin對表達釀酒酵母S.cerevisiae YBS40(MT-Yeast)、人(MT-Huamn)和 SAR-CoV MTaseCMT-SARS)N7 甲基轉移酶的 YBS40酵母菌株生長的抑制。(B)終濃度為0.1 μ M的Sinefungin作為甲基轉移酶藥物，對屬于其他組成員的冠狀病毒，在酵母體內表達的N7甲基轉移酶活性的抑制情況(C)Sinefungin對MT-Yeast、MT-Human 和 MT-SARS 生長的抑制。IC50 (inhibitor concentration at50%activity)的值如圖所示。(D) Sienfungin對屬于冠狀病毒屬其他組成員病毒在酵母體內表達的N7甲基轉移酶活性的抑制情況及其IC50值。
[0028]圖5.酵母遺傳學為基礎的冠狀病毒N7甲基轉移酶抑制劑篩選平臺的優化。
[0029](A)、(B)、(C)采用384孔板作為篩藥工具，用吸光值及細胞直接計數兩種方式測定轉化有pMceK294A空載體的YBS40酵母菌株的生長曲線，兩種方法測得的數據之間具有較強的相關性，回歸方程y=8.4032x+0.0483(R2=0.9917).(D)、(E)在384微孔板中，測定SIN對轉化有不同種屬甲基轉移酶酵母菌株的生長抑制情況，劑量反應曲線及IC50如圖所示(每個實驗組設置六個重復)。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。
[0031]實施例1用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選系統的構建
[0032]釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae YBS40(MATa Ieu2ade2trplhis3ura3canlabdl::hisGp360-ABDl)是 Mao 及其同事構建的(Mao, X.，1995.Mol CellBiol 15，4167-74.)。pMceK294A酵母載體是在Saha及其同事構建的YX232MA質粒(Saha, N.,.J Biol Chem274, 16553-62.)的基礎上，由本實驗室陳宇及其同事構建的，包括pMceK294A-HcmI 質粒(Chen, Y.,Proc Natl Acad Sci U S A106, 3484-9.)。
[0033]將SARS-CoV、MHV、TGEV, IBV的非結構蛋白14 (nsp 14)的編碼序列以各自的 cDNA (SARS-CoV WHU strain (GenBank accession n0.AY394850), MHV-A59(GenBankaccession n0.AY700211.1), TGEV(GenBank accession n0.FJ755618.2), and IBV(GenBankaccession n0.AJ311317.1))為模板，經PCR擴增得到其基因序列，然后插入到酵母載體 pMceK294A(2ym，TRPl)的 `BamHI 和 XhoI 位點中。MERS-CoV (GenBank accessionn0.KF192507.1)的nspl4序列(SEQ ID N0.1)經生物化學合成所得，并同樣克隆到酵母載# pMceK294A(2 μ m, TRP1)上。
[0034]相關引物如下:
[0035]F YX232MA-MERS-CoV nspl4BamH1:
[0036]5， -CGC ggatcc at TCTCAGATTGTAACTGGCCTTTTTA-3’
[0037]R YX232MA-MERS-CoV nspl4Xho1:
[0038]5’ -CCG ctcgag TTGAACTTTTGTAAAAGTAGACCAGAGA-3’
[0039]F YX232MA-TGEV nspl4BamH1:
[0040]5’ -CGC ggatcc ac GCGAAACCTGAAACTTGTGGTTTAT-3，
[0041]R YX232MA-TGEV nspl4Xho1:
[0042]5’ -CCG ctcgag CTGAAGTGCTTTGCTATTAACAAAA-3’
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[0044]5’ -CGC ggatcc ac GCAAAACCTGAAATTTGTGGTTTGT-3，
[0045]R YX232MA-FCoV nspl4Xho1:
[0046]5’ -CCG ctcgag CTGGAGTGCTTTGATATTAACAAAA-3’
[0047]F YX232MA-1BV nspl4BamH1:
[0048]5’ -CGC ggatcc ac GGTACAGGTTTGTTTAAAATTTGCAA-3’[0049]R YX232MA-1BV nspl4Xho1:
[0050]5’ -CCG ctcgag CTGGAGAGCTGAAAAACTTTTCCAT-3，
[0051]酵母表達質粒的轉化
[0052]一步法:
[0053]轉化過程中每個待轉化酵母表達質粒對應的轉化緩沖液:
[0054]105 μ L轉化混合液:
【權利要求】
1.用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的酵母細胞株，其包括表達各種冠狀病毒的非結構蛋白nspl4但自身N7甲基轉移酶缺失的酵母。
2.根據權利要求1所述的用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的酵母細胞株，其特征在于，所述冠狀病毒為SARS、MERS-CoV, MHV、TGEV或IBV。
3.根據權利要求1或2所述的用于抗冠狀病毒藥物高通量篩選的酵母細胞株，其特征在于，所述酵母含有質粒:pMceK294A-SARS-CoV-nspl4、pMceK294A-MERS-CoV_nspl4、pMceK294A-MHV-CoV-nspl4、pMceK294A-TGEV-CoV-nspl4 或 pMceK294A-1BV-CoV_nspl4。
4.權利要求1~3任一項所述的細胞株在抗冠狀病毒藥物高通量篩選中的應用。
5.一種抗冠狀病毒藥物高通量篩選的方法，該方法是將權利要求1~3任一項所述的細胞株在Trp-營養缺陷的培養基上培養，加入待選藥物，通過考察藥物對不同轉基因的酵母抑制率，篩選藥物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，該方法使用96微孔板及384微孔板作為篩選工具。
7.根據權利要求5或6所述的方法,其特征在于，所述的Trp-營養缺陷的培養基為Trp-營養缺陷的SD液體培養基。
8.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，將經5-F0A篩選平板上生長的權利要求1~4任一項所述的細胞株接種于Trp-營養缺陷的SD液體培養基中，然后加入測試藥物，通過反應酵母細胞生長數目的吸光值法來確定藥物對表達不同種屬N7甲基轉移酶蛋白的酵母菌株生長的抑制情況。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555599SQ201310542910
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】郭德銀, 陳宇, 孫穎, 陶佳莉, 王一 申請人:武漢大學