高血壓易感基因組的鑒定的制作方法

高血壓易感基因組的鑒定的制作方法
【專利摘要】本申請涉及高血壓易感基因組的鑒定。本發明提供包含能夠用于判定高血壓發病的風險的SNP的遺傳標記、能夠作為用于檢測該遺傳標記的引物或探針使用的多核苷酸、使用該SNP的高血壓發病風險判定方法、用于該SNP的分型的微陣列及用于該高血壓發病風險判定方法的試劑盒。
【專利說明】高血壓易感基因組的鑒定
[0001]本申請是申請日為2009年2月20日、申請號為200980114066.0、發明名稱為“高
血壓易感基因組的鑒定”的申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及包含能夠用于判定高血壓發病風險的SNP的遺傳標記、能夠作為用于檢測該遺傳標記的引物或探針使用的高血壓發病風險判定用多核苷酸、使用該SNP的高血壓發病風險判定方法、用于該SNP的分型的高血壓發病風險判定用微陣列、及用于該高血壓發病風險判定方法的試劑盒等。
[0003]本申請要求2008年2月21日在日本申請的日本特愿2008-040208號的優先權，并將其內容援引于此。
【背景技術】
[0004]高血壓是例如冠狀動脈疾病、腦中風、慢性腎病等的主要發病原因，高血壓的預防在社會和公共衛生上是很重要的。高血壓是通過很多原因而誘發發病的多因素疾病，將這些誘發高血壓的原因稱作危險因素(風險因素，risk factor)。高血壓的危險因素主要大致分為環境因素和遺傳因素，認為它們的相互作用發揮著重要的作用。
[0005]危險因素中，作為環境因素，例如可列舉出年齡的增長、肥胖、壓力、過量攝取鹽分等。另一方面，作為遺傳因素，已知有各種高血壓易感基因。這里，“高血壓易感基因”是指，由于具有所述基因而引發高血壓的危險率上升的基因。也就是說，可判斷的是，具有高血壓易感基因的人與不具有高血壓易感基因的人相比，更容易罹患高血壓。并且認為，在高血壓那樣的多因素疾病中，其易感基因很多是表現為單核苷酸多態性(SNP)等多態性的等位基因(等位基因)。
[0006]迄今為止，作為含有基因多態性的高血壓易感基因，報告有血管緊張素原、α-內收蛋白、β 2腎上腺素受體、糖蛋白Ia (GPIa)、趨化因子受體2 (CCR2)、載脂蛋白C (ApoC-1II )、G-蛋白β3亞基(GP0 3)、腫瘤壞死因子a (TNF α )、胰島素受體底物I(IRS-1)、糖蛋白 Iba (GPIba )、C-型利鈉肽(CNP)、血紅素氧合酶 I (ΗΜ0Χ-1 )、SCNNlA 等各種基因(例如參照專利文獻I~4。)。此外，近年來，報告了 CYP17基因(rs6162)多態性、EX0SC3 基因(rs7158)多態性、ACCNl 基因(rs28933)多態性、KCNMB4 基因(rs710652)多態性、KCNIP2基因(rS755381)多態性、ATP2A3基因(rs887387 )多態性、RAC2基因(rs929023)多態性、CD3EAP 基因(rs967591)多態性、CALCR 基因(rsl042138)多態性、ATPlOD 基因(rsl058793)多態性、GNA14 基因(rsl801258)多態性、PTHRl 基因(rsl869872)多態性、ATP2B1 基因(rs2070759)多態性、HLA-DMB 基因(rs2071556)多態性、SLC13A1 基因(rs2140516)多態性、SLC2A11 基因(rs2236620)多態性、GNAI2 基因(rs2236943)多態性、CACNA2D2 基因(rs2236957)多態性、PRKffNKl 基因(rs2255390)多態性、SLC22A7 基因(rs2270860)多態性、KCNNl 基因(rs2278993)多態性、SLC21A6 基因(rs2291075)多態性、CACNA1E 基因(rs2293990)多態性、SLC26A8 基因(rs2295852)多態性、ERCCl 基因(rs2298881)多態性、DLGAP2 基因(rs2301963)多態性、C0L4A1 基因(rs2305080)多態性、⑶CAlC 基因(rs2715709)多態性、ATPlOC 基因(rs3736186)多態性、HCN4 基因(rs3743496)多態性、PTPRT基因(rs3746539)多態性、FGF2基因(rs3747676)多態性、CHGA基因(rs3759717)多態性、PPP1R1B 基因(rs3764352)多態性、ADORAl 基因(rs3766554)多態性、RGS19IP1基因(rs3815715)多態性、RGS20基因(rs3816772)多態性有望作為高血壓易感基因多態性(例如參照專利文獻5。)。
[0007]高血壓的治療是為了防止由高血壓誘發的冠狀動脈疾病等的發病而以降低血壓為目的。治療方法主要大致分為通過改善飲食生活等生活習慣來減輕高血壓的危險因素、和降壓治療劑的給藥療法。通常，判斷各患者的風險，根據該判定結果和實際的血壓，決定降壓目標和治療方法。例如，首先，將收縮期血壓/舒張期血壓為140~159/90~99mmHg分類為輕癥高血壓，將160~179/100~109mmHg分類為中癥高血壓，將蘭180/ ^ IlOmmHg分類為重癥高血壓后，考慮除血壓以外的危險因素而判斷風險。例如，將為輕癥高血壓且不具有其他危險因素的患者判斷為低風險組，將為輕癥高血壓且具有一些危險因素的患者判斷為中等風險組，將為輕癥聞血壓但具有糖尿病等危險性聞的危險因素的患者判斷為聞風險組。通常，為低風險組和中等風險組時，首先，進行一定時期的生活習慣的改正，其后在血壓沒有充分降低的情況下進行給藥療法，但對于高風險組的患者，與一定時期的生活習慣的改正同時進行給藥療法。即，即使血壓為相同程度，也未必是相同的治療方法，根據各患者的風險而適當選擇治療方法。因此，正確評價高血壓發病的風險是非常重要的。
[0008]大部分的危險因素各自單獨未必是高血壓發病的誘因。特別是作為遺傳因素的高血壓易感基因的情況下，認為是所具有的多個高血壓易感基因相互影響，結果誘發了高血壓。因此，在高血壓發病的風險評價中，所具有的高血壓易感基因的數量越多，則判斷為越高風險組。因此認為，通過調查盡可能多的高血壓易感基因的有無，從而能夠更準確地評價高血壓發病的風險，但已報告有很多高血壓易感基因，對它們全部進行檢查從評價的迅速性及經濟性的觀點出發并不優選。另外，該基因存在與否和高血壓發病的相關性因高血壓易感基因的不同而不同，因此，以相關性比較低的高血壓易感基因作為風險評價的判斷資料時，無法得到可靠性高的評價。
[0009]專利文獻1:日本特開2004-222503號公報
[0010]專利文獻2:日本特開2004-113094號公報
[0011]專利文獻3:日本特開2004-33051號公報
[0012]專利文獻4:日本特開2004-24125號公報
[0013]專利文獻5:日本特開2007-143504號公報

【發明內容】

`[0014]發明要解決的問題
[0015]即，為了準確地評價高血壓發病的風險，優選使用與高血壓易感基因高血壓發病的相關性高的有用的高血壓易感基因作為遺傳標記，更優選組合使用現實中臨床上能夠測定的范圍內的數個有用的高血壓易感基因作為遺傳標記。然而，對于迄今為止報告的高血壓易感基因，雖然觀察到了存在與否和高血壓發病具有相關性，但相關的程度不充分，另外，幾乎不存在能夠進一步提高風險評價的可靠性的高血壓易感基因的組合。[0016]本發明的目的在于提供:包含存在與否和高血壓發病的相關性充分高且能夠用于高血壓發病的風險判定的SNP的遺傳標記、能夠作為用于檢測該SNP的引物或探針使用的高血壓發病風險判定用多核苷酸、使用該SNP的高血壓發病風險判定方法、用于該SNP的分型的高血壓發病風險判定用微陣列、及用于該SNP的分型的高血壓發病風險判定用試劑
合坐 [0017]用于解決問題的方案
[0018]本發明人等為了解決上述問題而進行了深入研究，結果發現，以從8924人采集的基因組DNA為對象，調查病例(高血壓)組和對照(正常血壓)組中的SNP的頻率差并進行病例對照相關分析，結果是，ATP2B1基因和CYP11B2基因的SNP、特別是ATP2B1基因的SNP(rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、CYP11B2 基因的SNP (rsl799998)作為高血壓的遺傳標記是非常有用的，進而，通過將選自由這些SNP、及AGT基因的SNP (rs699)所組成的組中的2種以上SNP組合，與各種SNP單獨相比，能夠更準確地判斷高血壓發病風險，從而完成了本發明。
[0019]即，本發明的第一方案提供一種高血壓的遺傳標記，其特征在于，由與包含ATP2B1基因的SNP (單核苷酸多態性)的ATP2B1基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的序列構成，所述 SNP 為選自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、及SNP (rslll05364)所組成的組中的I種以上。
[0020]另外，本發明的第二方案提供一種高血壓發病風險判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中任一堿基序列，且能夠作為用于檢測SNP (rslll05378)的引物或探針使用；(a)序列號5所示的堿基序列、或序列號5所示的堿基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列；(b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列；(c)在所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列；(d)序列號6所示的堿基序列、或序列號6所示的堿基序列的包含SNP (rslll05378)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)在所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0021]另外，本發明的第三方案提供一種高血壓發病風險判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列，且能夠作為用于檢測SNP (rs2681472)的引物或探針使用；(a)序列號12所示的堿基序列、或序列號12所示的堿基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列；(b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列；(c)在所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列；(d)序列號13所示的堿基序列、或序列號13所示的堿基序列的包含SNP (rs2681472)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)在所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。[0022]另外，本發明的第四方案提供一種高血壓發病風險判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列，且能夠作為用于檢測SNP (rsl401982)的引物或探針使用；(a)序列號19所不的喊基序列、或序列號19所不的喊基序列的包含SNP(rsl401982)的部分序列；(b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列；(c)在所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列；(d)序列號20所示的堿基序列、或序列號20所示的堿基序列的包含SNP (rsl401982)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)在所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0023]另外，本發明的第五方案提供一種高血壓的遺傳標記，其特征在于，其由與包含CYP11B2基因的SNP即SNP (rsl799998)的CYP11B2基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的堿基序列構成。
[0024]另外，本發明的第六方案提供一種高血壓發病風險判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列，且能夠作為用于檢測SNP (rsl799998)的引物或探針使用；(a)序列號26所示的堿基序列、或序列號26所示的堿基序列的包含SNP(rs 1799998)的部分序列；(b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列；(c)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rsl799998)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的喊基序列；(d)序列號27所的喊基序列、或序列號27所的喊基序列的包含SNP (rsl799998)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)在所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rsl799998)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交`的堿基序列。
[0025]另外，本發明的第七方案提供一種高血壓發病風險判定方法，其特征在于，其是使用遺傳標記來判斷高血壓發病風險的方法，其具有以下工序:(a)對由人個體采集的核酸的、選自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、及SNP (rsl799998)所組成的組中的I種以上進行分型的工序；(b)根據由所述工序(a)得到的分型結果來判斷所述人個體的高血壓發病風險的工序。
[0026]本發明的第七方案中，所述工序(a)進一步優選為對AGT基因的SNP即SNP(rs699)進行分型的工序。
[0027]另外，本發明的第八方案提供一種高血壓發病風險判定用微陣列，其特征在于，在固相載體上固定有選自由本發明的第二、第三、第四、及第六方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸所組成的組中的I種以上。
[0028]本發明的第八方案中，優選進一步在所述固相載體上固定具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列、且能夠作為用于檢測SNP (rs699)的引物或探針使用的多核苷酸；(a)序列號33所示的堿基序列、或序列號33所示的堿基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列；(c)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列；(d)序列號34所示的堿基序列、或序列號34所示的堿基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP(rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由該所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0029]另外，本發明的第九方案提供一種高血壓發病風險判定用SNP分型試劑盒，其特征在于，其包含選自由本發明的第二方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第三方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第四方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第六方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、及本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列所組成的組中的I種以上。
[0030]另外，本發明的第十方案提供一種高血壓發病風險判定用SNP分型試劑盒，其特征在于，其包含選自由本發明的第二方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第三方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第四方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第六方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列、及具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列且能夠作為用于檢測SNP (rs699)的引物及探針使用的多核苷酸所組成的組中的I種以上；(a)序列號33所示的堿基序列、或序列號33所示的堿基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(b)與所述Ca)的堿基序列互補的堿基序列；(c)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b )的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列；(d)序列號34所示的堿基序列、或序列號34所示的堿基序列的包含SNP (rs699)的部分序列；(e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列；(f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
`[0031]另外，本發明的第十一方案提供一種ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組載體，其特征在于，其包含用1xP序列夾持ATP2B1基因的堿基序列的全部或一部分而成的堿基序列。
[0032]另外，本發明的第十二方案提供一種ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組小動物，其特征在于，使用本發明的第十一方案的載體制作得到。
[0033]另外，本發明的第十三方案提供一種ATP2B1基因局部缺失小動物，其特征在于，其通過使選擇性Cre表達轉基因小動物與作為本發明的第十二方案的ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組小動物交配而制得，所述選擇性Cre表達轉基因小動物以選自由下述啟動子所組成的組中的一種啟動子作為Cre重組酶(Cre Recombinase)的表達啟動子:Tie-2啟動子、Tie-1啟動子、Flk-1啟動子、SM22啟動子、SM-MHC啟動子、Wtl啟動子、PO啟動子、Pax3啟動子、a MHC啟動子、Nkx2.5啟動子、Tbxl啟動子、四環素誘導(tetracycline-1nducible)啟動子、及CMV增強子-雞β -肌動蛋白(CMVenhancer-chicken β -actin)啟動子。[0034]另外，本發明的第十四方案提供一種ATP2B1基因的局部缺失小動物的使用方法，其特征在于，使用作為本發明的第十三方案的ATP2B1基因局部缺失小動物作為用于篩選鈣拮抗藥的試驗動物。
[0035]發明的效果
[0036]作為本發明的第一方案和/或第五方案的高血壓的遺傳標記是包含存在與否和高血壓發病的相關性充分高的SNP的遺傳標記。因此，通過利用使用了本發明的高血壓的遺傳標記的本發明的第七方案即高血壓發病風險判定方法，能夠得到可靠性更高的判定結果O
[0037]另外，通過利用作為本發明的第二~第四方案及第六方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸、固定有該高血壓發病風險判定用多核苷酸的作為本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列、具有該高血壓發病風險判定用多核苷酸或該高血壓發病風險判定用微陣列的作為本發明的第九方案和/或第十方案的高血壓發病風險判定用SNP分型試劑盒中的任一者，從而能夠準確且簡便地檢測作為本發明的高血壓的遺傳標記的SNP，能夠高精度且有效地判定高血壓發病風險。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為其他SNP的評價方法中的頻率X風險值的直方圖。
【具體實施方式】
[0038]本發明中，“高血壓”是指，全身的動脈壓一過性或持續地高達可能誘發心血管系統障礙等障礙的水平的狀態。高血壓的具體的定義沒有特別限定，例如根據日本高血壓學會制定的《高血壓治療準則2004》(JSH2004)是指收縮期血壓/舒張期血壓為140/90mmHg以上的狀態。除了在沒有服用降壓藥等的狀態下收縮期血壓為HOmmHg以上、舒張期血壓為90mmHg以上的情況以外,還包括收縮期血壓不到140mmHg、但舒張期血壓為90mmHg以上的情況，以及舒張期血壓不到90mmHg、但收縮期血壓為140mmHg以上的情況。另外，高血壓主要大致分為原發性高血壓和繼發性高血壓,90%以上被分類為原發性高血壓，本發明中，優選原發性高血壓。
[0039]本發明中，“高血壓的遺傳標記”是指成為高血壓的遺傳因素的標記的基因。本發明的聞血壓的遺傳標記包含SNP,作為其等位基因(等位基因)，包含聞血壓易感基因。
[0040]本發明中，“高血壓發病風險”是指高血壓的易罹患性(容易患高血壓的程度)。即，本發明中，某些人個體為高風險組是指推測該人個體誘發高血壓的危險率高，為低風險組是指推測該人個體誘發高血壓的危險率低。
[0041]本發明中，SNP優選注冊于公共數據庫的SNP，能夠從其參考號(referencenumber)確定的 SNP。例如有通過 NCBI (National center for BiotechnologyInformation)的SNP數據庫(dbSNP BHLD124)的參考號即rs號確定的SNP、通過東京大學醫科學研究所整理的日本人的SNP的數據庫JSNP (注冊商標)(http://snp.1ms.u-toky0.ac.jp/index_ja.html)的參考號即 IMS-JST 號確定的 SNP 等。
[0042]作為本發明的第一方案的高血壓的遺傳標記包含SNP，作為等位基因，包含ATP2BI (ATPase，Ca2+運輸，質膜I)基因。具體而言，其特征在于，作為ATP2B基因的SNP，由與包含選自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)所組成的組中的I種以上的ATP2B1基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的序列構成。該遺傳標記所包含的ATP2B基因的SNP可以為I種，也可以為2種以上。例如，可以僅為 SNP (rslll05378)，可以僅為 SNP (rs2681472)，可以僅為 SNP (rsl401982)，也可以僅為 SNP (rslll05364)。另外，可以為 SNP (rslll05378)與 SNP (rs2681472)的組合，可以為 SNP (rslll05378)與 SNP (rsl401982)的組合，可以為 SNP (rs2681472)與 SNP(rsl401982)的組合，也可以為 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)與SNP (rsl 1105364)的組合。
[0043]ATP2B1是在正常血壓組和高血壓組中表達量顯著增大的酶，ATP2B1基因是公知的高血壓易感基因。據報道，人的ATP2B1基因(NCBI登錄號:NC_000012)中，例如，啟動子區域存在的SNP (rs2070759)在各多態性的高血壓發病風險中存在顯著差異(例如，參照專利文獻5。)等，但該結果的顯著性并不足以用于診斷。另一方面，據報道，在原發性高血壓患者44名(病例組)和正常血壓者40名(對照組)中，對于ATP2B1基因的所有22個外顯子進行了 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism,單鏈構象多態性)分析和HTX (Heteroduplex，異質性雙鏈構象多態性)分析，結果盡管靈敏度為100%，但在病例組和對照組中并沒有觀察到顯著差異(例如，參照G.R.Monteith et al.^Biochemical andbiophysical research communications、1997 年、第 230 卷第 2 號、第 344 ~346 頁。)。即，本發明人等首次發現如下見解:ATP2B1基因為公知的高血壓易感基因，認為ATP2B1的表達量的多少對于高血壓發病風險很重要，高血壓發病風險根據啟動子區域以外的SNP等基因多態性的不同而不同。
[0044]這里，SNP (rslll05378)為T/C多態性，由后述實施例3的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓組中，C等位基因的頻率顯著高于T等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。
[0045]另外，SNP (rs2681472)為G/A多態性，由后述實施例9的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓 組中，A等位基因的頻率顯著高于G等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。
[0046]另外，SNP (rsl401982)為A/G多態性，由后述實施例15的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓組中，G等位基因的頻率顯著高于A等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。
[0047]進而，SNP (rslll05364)為G/T多態性，由后述實施例21的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓組中，T等位基因的頻率顯著高于G等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。
[0048]作為本發明的第五方案的高血壓的遺傳標記包含SNP，作為等位基因，包含CYP11B2 (細胞色素P450，亞家族XIB2)基因。具體而言，其特征在于，由與包含CYP11B2基因的SNP即SNP (rsl799998)的CYP11B2基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的堿基序列構成。SNP (rsl799998)為C/T多態性，由后述實施例28的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓組中，T等位基因的頻率顯著高于C等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。另外，未有報道指出CYP11B2基因特別地顯示出與高血壓相關的見解，CYP11B2基因為高血壓易感基因是本發明人等首次發現的見解。[0049]作為本發明的第七方案的高血壓發病風險判定方法是利用作為本發明的第一方案和/或第五方案的高血壓的遺傳標記(以下有時也稱為“本發明的高血壓的遺傳標記”。)來判定高血壓發病的風險的方法。具體而言，其特征在于，其包括以下工序:(a)對由人個體采集的核酸的、選自由 SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP(rslll05364)、及SNP (rsl799998)所組成的組中的I種以上進行分型的工序；和(b)根據通過所述工序(a)獲得的分型結果來判定所述人個體的高血壓發病風險的工序。SNP(rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、SNP (rsl799998)中的任意一種的多態性之間，在高血壓的易發病性方面統計學上都顯著不同，因此能夠由所鑒定的SNP的基因型判定高血壓發病風險。
[0050]首先，作為工序(a)，對由人個體采集的核酸的、選自由SNP (rslll05378)、SNP(rs2681472)、SNP (rsl401982)、SNP (rslll05364)、及 SNP (rsl799998)所組成的組中的I種以上進行分型。
[0051]本發明中，“對SNP進行分型”意味著，測定核酸的堿基序列，檢測SNP，從而鑒定多態性。例如，鑒定作為判定對象的核酸的SNP (rslll05378)為TT型、TC型、CC型中的哪一者。
[0052]供于SNP分型的核酸只要是從人個體采集的，則沒有特別限定，可以是血液、體液等生物試樣(待測物)中所含有的核酸、或者從這些生物試樣等提取的核酸，也可以是以這些核酸為模板擴增得到的核酸。另外，也可以是利用逆轉錄酶由生物試樣中所含有的RNA合成的cDNA。
[0053]SNP的分型方法只要是通常用于SNP的檢測的方法，則沒有特別限定。例如，可列舉出 InvadeK商標、Third Wa·ve Technologies公司)法、TaqMan(商標、Applied Biosystems公司)法、MALD1-T0F質譜法、微陣列法、測序法、利用PCR (聚合酶鏈反應)等堿基序列擴增法的檢測法等。特別是優選像TaqMan法、PCR法、微陣列法等那樣的使用與各多態性特異性雜交的引物或探針來檢測SNP的方法。例如，在PCR法中，以僅與野生型等位基因完全互補的多核苷酸作為野生型引物，以僅與突變型等位基因完全互補的多核苷酸作為突變型引物的情況下，以包含SNP的核酸作為模板利用各引物進行PCR，通過是否能夠得到PCR產物，能夠鑒定SNP的基因型。同樣地，以僅與野生型等位基因完全互補的多核苷酸作為野生型探針，以僅與突變型等位基因完全互補的多核苷酸作為突變型探針的情況下，通過使用固定有包含SNP的核酸的微陣列并利用各探針時能否雜交，能夠鑒定SNP的基因型。這些使用對各SNP特異性的探針或引物的方法與測序法等不同，由于可直接識別SNP，因此可靠性更高，另外，SNP分型所需要的時間短，且簡便。
[0054]另外，使用對各SNP特異性的引物進行PCR時獲得的PCR產物的檢測可通過通常用于檢測和定量PCR產物時的任意方法來進行。例如，可通過電泳來檢測，可以通過使用SYBR Green等熒光嵌入劑的實時PCR來檢測，也可以通過單分子熒光分析法(singlemolecule fluorescence analysis)來檢測。
[0055]能夠作為用于檢測SNP的引物或探針使用的高血壓發病風險判定用多核苷酸，只要是能夠與包含該SNP的基因的包含該SNP在內的部分區域或其互補鏈雜交的多核苷酸，則沒有特別限定。另外，高血壓發病風險判定用多核苷酸的堿基長度、Tm值等可考慮分型方法、反應條件等適當決定，但作為高血壓發病風險判定用多核苷酸的堿基長度，優選為10~60個堿基長度，更優選為15~50個堿基長度。
[0056]這種高血壓發病風險判定用多核苷酸的設計可采用該【技術領域】中眾所周知的方法中的任一者來進行。例如，利用公知的基因組序列數據和通用的引物設計工具，能夠簡便地設計。作為該引物設計工具，例如有網絡上能夠利用的Primerf等。另外，公知的基因組序列數據通常能夠在作為國際性的堿基序列數據庫的NCB1、或DDBJ (DNA Data Bank ofJapan)等中獲得。
[0057]這樣設計的高血壓發病風險判定用多核苷酸可采用該【技術領域】中眾所周知的方法中的任一者來合成。例如，可依賴于合成公司來合成，也可以使用市售的合成機獨自合成。
[0058]作為用于檢測ATP2B1基因上的SNP (rslll05378)的引物或探針，特別優選使用具有下述的(a)~(f)中任一堿基序列的、作為本發明的第二方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸(以下稱為“SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸”。)。
[0059](a)序列號5所示的堿基序列、或序列號5所示的堿基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列。
[0060](b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列。
[0061](C)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0062](d)序列號6所示的堿基序列、或序列號6所示的堿基序列的包含SNP(rslll05378)的部分序列。
[0063](e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列。
[0064](f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rslll05378)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0065]另外，具有上述(a)~(C)中的任一堿基序列的SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rslll05378)的C等位基因(C allele)的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一堿基序列的SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rslll05378)的T等位基因(T allele)的多核苷酸。
[0066]作為用于檢測ATP2B1基因上的SNP (rs2681472)的引物或探針，特別優選使用具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列的、作為本發明的第三方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸(以下稱為“SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸”。)。
[0067](a)序列號12所示的堿基序列、或序列號12所示的堿基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。
[0068](b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列。
[0069](C)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多 核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0070](d)序列號13所示的堿基序列、或序列號13所示的堿基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。[0071](e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列。
[0072](f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rs2681472)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0073]另外，具有上述(a)~(C)中的任一堿基序列的SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rs2681472)的A等位基因(A allele)的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一堿基序列的SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rs2681472)的G等位基因(G allele)的多核苷酸。
[0074]作為用于檢測ATP2B1基因上的SNP (rsl401982)的引物或探針，特別優選使用具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列的、本發明的第四方案即高血壓發病風險判定用多核苷酸(以下稱為“SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸”。)。
[0075](a)序列號19所示的堿基序列、或序列號19所示的堿基序列的包含SNP(rs 1401982)的部分序列。
[0076](b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列。
[0077](C)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0078](d)序列號20所示的堿基序列、或序列號20所示的堿基序列的包含SNP(rs 1401982)的部分序列。
[0079](e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列。
[0080](f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rsl401982)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0081]另外，具有上述(a)~(C)中的任一堿基序列的SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rsl401982)的G等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一堿基序列的SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rsl401982)的A等位基因的多核苷酸。
[0082]另外，作為用于檢測CYP11B2基因上的SNP (rsl799998)的引物或探針，特別優選具有下述的(a)~(f)中的任一堿基序列的、作為本發明的第五方案的高血壓發病風險判定用多核苷酸(以下稱為“SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸”。)。
[0083](a)序列號26所示的堿基序列、或序列號26所示的堿基序列的包含SNP(rsl799998)的部分序列。
[0084](b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列。
[0085](C)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs 1799998)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0086](d)序列號27所示的堿基序列、或序列號27所示的堿基序列的包含SNP(rsl799998)的部分序列。
[0087](e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列。[0088](f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rs 1799998)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0089]另外，具有上述(a)~(C)中的任一堿基序列的SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rsl799998)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一堿基序列的SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸是能夠檢測SNP (rsl799998)的C等位基因的多核苷酸。
[0090]另外，本發明中，“嚴格的條件下”例如可列舉出:在5XSSC (150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉、pH7.4)+0.3%SDS (十二烷基硫酸鈉)中熱變性后，在65°C下雜交4~16小時，分別用常溫的2 X SSC+0.1%SDS、及2 X SSC各洗滌5分鐘，并用0.05 X SSC沖洗等。
[0091]此外，工序(a)中使用的高血壓發病風險判定用多核苷酸中，除與檢測對象的基因的堿基序列互補或相同的序列以外，還能夠以不阻礙SNP分型的程度具有附加的序列。作為該附加的序列，例如有限制酶識別序列、提供核酸標記的序列等。另外，為了易于檢測和分析SNP分型結果，各高血壓發病風險判定用多核苷酸中能夠以不阻礙SNP分型的程度添加標記物。該標記物只要是通常用于標記多核苷酸的化合物，則沒有特別限定。作為該標記物，例如有放射性同位素、熒光物質、化學發光物質、生物素等低分子化合物等。
[0092]另外，由人個體采集的核酸、高血壓發病風險判定用多核苷酸等在SNP分型中的用量沒有特別限定，能夠以通常的用量使用。另外，聚合酶等酶、核苷酸、反應用緩沖液等沒有特別限定，能夠以通常的用量使用通常進行SNP分型時使用的物質。
[0093]接下來，作 為工序(b)，根據通過工序(a)獲得的分型結果來判定所述人個體的高血壓發病風險。例如，高血壓發病風險可利用下述表2、8、14、20、25等的比值比(odds ratio)來判定。此外,可以利用對本發明的高血壓的遺傳標記進行薈萃分析(Metaanalysis)而得到的比值比來判定，可以利用對本發明的高血壓的遺傳標記進行隊列研究而得到的相對危險度(風險比)來判定，也可以采用其他現有公知的統計方法并利用經統計學處理的值來判定。
[0094]具體而言，利用SNP (rslll05378)的分型結果時，可按照CC型、TC型、TT型的順序判定風險由高到低。此外，SNP (rslll05378)為TT型時，可判定為低風險組；為TC型或CC型時，可判定為高風險組。
[0095]利用SNP (rs2681472)的分型結果時，可按照AA型、AG型、GG型的順序判定風險由高到低。此外，SNP (rs2681472)為GG型或AG型時，可判定為低風險組；為AA型時，可判定為高風險組。
[0096]利用SNP (rsl401982)的分型結果時，可按照GG型、AG型、AA型的順序判定風險由高到低。此外，SNP (rsl401982)為AA型時，可判定為低風險組；為AG型或GG型時，可判定為高風險組。
[0097]利用SNP (rsl1105364)的分型結果時，可按照TT型、TG型、GG型的順序判定風險由高到低。此外，SNP (rslll05364)為GG型時，可判定為低風險組；為TT型或TG型時，可判定為高風險組。
[0098]另一方面，利用SNP (rsl799998)的分型結果時，可按照TT型、CT型、CC型的順序判定風險由高到低。此外，SNP (rsl799998)為CC型或CT型時，可判定為低風險組；為TT型時，可判定為高風險組。
[0099]另外，組合本發明的遺傳標記時，與單獨時相比，能夠更準確地判定高血壓發病風險。例如，SNP (rslll05378)為TT型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型時，可判定為低風險組；SNP (rslll05378)為TC型或CC型，SNP (rsl799998)為TT型時，可判定為高風險組。另外，SNP (rs2681472)為GG型或AG型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型時，可判定為低風險組；SNP (rs2681472)為AA型，SNP (rsl799998)為TT型時，可判定為高風險組。SNP (rsl401982)為AA型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型時，可判定為低風險組；SNP (rsl401982)為AG型或GG型，SNP (rsl799998)為TT型時，可判定為高風險組。SNP (rslll05364)為GG型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型時，可判定為低風險組；SNP(rslll05364)為TT型或TG型，SNP (rsl799998)為TT型時，也可判定為高風險組。
[0100]此外，本發明的遺傳標記也能夠與其他高血壓的遺傳標記組合使用。組合的遺傳標記沒有特別限定，也可以組合公知的高血壓的遺傳標記。特別優選與具有如下特征的高血壓的遺傳標記組合，所述高血壓的遺傳標記的特征在于，其由與包含AGT (encodingAngiotensinogen，血管緊張肽原)基因的SNP即SNP (rs699)的AGT基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的序列構成。
[0101]AGT基因是具有多個SNP的公知的高血壓易感基因。SNP (rs699)為Μ/T多態性，由后述實施例28的結果可知，與正常血壓組相比較的情況下，高血壓組中，T等位基因的頻率顯著高于M等位基因，作為高血壓的遺傳標記是有用的。因此，例如，SNP (rs699)為麗型或MT型時，可判定為低風險組；為TT型時，可判定為高風險組。另外，本申請說明書中，M為蛋氨酸(Met)，T表示蘇氨酸(Thr)。這里，作為堿基序列，MM型為TT型所表現出的多態性，MT型為TC型所表現出的多態性，TT型為CC型所表現出的多態性。
[0102]SNP (rs699)的分型能夠與 SNP (rslll05378)、SNP (rsl799998)同樣地使用公知的SNP分型法來進行，優選的是，使用由與包含SNP (rs699)的AGT基因的部分堿基序列或全部堿基序列相同或互補的序列構成的多核苷酸作為引物或探針，通過SNP分型法來鑒定SNP。作為能夠作為用于檢測AGT基因上的SNP (rs699)的引物或探針使用的多核苷酸，優選具有下述的(a)~(f)中的任一堿`基序列的多核苷酸(以下稱為“SNP (rs699)檢測用多核苷酸”。)。
[0103](a)序列號33所示的堿基序列、或序列號33所示的堿基序列的包含SNP (rs699)的部分序列。
[0104](b)與所述(a)的堿基序列互補的堿基序列。
[0105](C)所述(a)或(b)的堿基序列中除SNP (rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(a)或(b)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。
[0106](d)序列號34所示的堿基序列、或序列號34所示的堿基序列的包含SNP (rs699)的部分序列。
[0107](e)與所述(d)的堿基序列互補的堿基序列。
[0108](f)所述(d)或(e)的堿基序列中除SNP (rs699)以外的I~數個堿基缺失、置換或添加而得到的堿基序列，且由該堿基序列構成的多核苷酸能夠與由所述(d)或(e)的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的堿基序列。[0109]另外,具有上述(a)~(c)中的任一堿基序列的SNP (rs699)檢測用多核苷酸為能夠檢測SNP (rs699)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)~(f)中的任一堿基序列的SNP (rs699)檢測用多核苷酸為能夠檢測SNP (rs699)的M等位基因的多核苷酸。
[0110]例如，根據SNP (rslll05378)和 SNP (rs699)的分型結果，SNP (rslll05378)為TT型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rslll05378)為TC型或CC型，SNP (rs699)為TT型時，可判定為高風險組。另外，根據SNP (rs2681472)和SNP(rs699)的分型結果，SNP (rs2681472)為GG型或AG型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rs2681472)為AA型，SNP (rs699)為TT型時，可判定為高風險組。另外，根據 SNP (rsl401982)和 SNP (rs699)的分型結果，SNP (rsl401982)為 AA 型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rsl401982)為AG型或GG型，SNP(rs699)為TT型時，可判定為高風險組。進而，根據SNP (rslll05364)和SNP (rs699)的分型結果，SNP (rslll05364)為GG型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rslll05364)為TT型或TG型，SNP (rs699)為TT型時，可判定為高風險組。此外，根據 SNP (rsl799998)和 SNP (rs699)的分型結果，SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型，SNP(rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rsl799998)為TT型，SNP (rs699)為TT型時，可判定為高風險組。
[0111]進而，通過組合作為本發明的第一方案的高血壓的遺傳標記、作為本發明的第五方案的高血壓的遺傳標記、以及由包含SNP (rs699)的AGT基因構成的高血壓的遺傳標記這3種遺傳標記，從而能夠獲得可靠性非常高的風險評價。例如，SNP (rslll05378)為TT型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rslll05378)為 TC 型或 CC 型，SNP (rsl799998)為 TT 型，SNP (rs699)為 TT 型時，可判定為高風險組。另外，SNP (rs2681472)為GG型或AG型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rs2681472)為AA型，SNP(rsl799998)為TT型，SNP ·(rs699)為TT型時，可判定為高風險組。進而，SNP (rsl401982)為AA型，SNP (rsl799998)為CC型或CT型，SNP (rs699)為MM型或MT型時，可判定為低風險組；SNP (rs 1401982)為 AG 型或 GG 型，SNP (rsl799998)為 TT 型，SNP (rs699)為 TT型時，可判定為高風險組。
[0112]另外，組合這3種遺傳標記，根據高風險多態性的數目、低風險多態性的數目等，也能夠進行更精細的風險評價。例如，高風險多態性的數目越多，則能夠判定高血壓發病風險越聞。另外，低風險多態性的數目越少，則能夠判定聞血壓發病風險越聞。此外，聞風險多態性的數目越少，則也能夠判定高血壓發病風險越低，低風險多態性的數目越多，則也能夠判定高血壓發病風險越低。
[0113]具體而言，以SNP (rslll05378)的 CC 型、SNP (rsl799998)的 TT 型、SNP (rs699)的TT型分別作為高風險多態性，能夠按照這些高風險多態性的個數為3個、2個、I個、O個的順序來判定風險由高到低。另外，以SNP (rs2681472)的AA型、SNP (rsl799998)的TT型、SNP (rs699)的TT型分別為高風險多態性，能夠按照這些高風險多態性的個數為3個、2個、I個、O個的順序來判定風險由高到低。進而，以SNP (rsl401982)的GG型、SNP(rsl799998)的TT型、SNP (rs699)的TT型分別作為高風險多態性，能夠按照這些高風險多態性的個數為3個、2個、I個、O個的順序來判定風險由高到低。[0114]另外，以SNP (rslll05378)的 TT 型、SNP (rsl799998)的 CC 型、SNP (rs699)的 MM型分別作為低風險多態性，能夠按照這些低風險多態性的個數為O個、I個、2個、3個的順序來判定風險由高到低。另外，以SNP (rs2681472)的GG型、SNP (rsl799998)的CC型、SNP(rs699)的MM型分別作為低風險多態性，能夠按照這些低風險多態性的個數為O個、I個、2個、3個的順序來判定風險由高到低。進而，以SNP (rsl401982)的AA型、SNP (rsl799998)的CC型、SNP (rs699)的MM型分別作為低風險多態性，也能夠按照這些低風險多態性的個數為O個、I個、2個、3個的順序來判定風險由高到低。
[0115]此外，例如，以SNP (rslll05378)為 TT 型，SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型，SNP(rs699)為MM型或MT型的情況作為第一組；以SNP (rslll05378)為TC型或CC型、SNP(rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 MM 型或 MT 型的情況，SNP (rslll05378)為 TT型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，或者，SNP (rslll05378)為TT型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP (rs699)為MM型或MT型的情況作為第二組；以SNP(rslll05378)為 TC 型或 CC 型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，SNP (rslll05378)為 TC 型或 CC 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為 MM 型或 MT 型的情況，或者 SNP (rslll05378)為 TT 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為TT型的情況作為第三組；以SNP (rslll05378)為TC型或CC型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP (rs699)為TT型的情況作為第四組；在所述工序(b)中，能夠按照所述第四組、所述第三組、所述第二組、所述第一組的順序判定風險由高到低。 [0116]另外，以SNP (rs2681472)為 GG 型或 AG 型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP(rs699)為 MM 型或 MT 型的情況作為第一組；以 SNP (rs2681472)為 AA 型、SNP (rsl799998)為CC型或CT型、SNP (rs699)為MM型或MT型的情況，SNP (rs2681472)為GG型或AG型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，或者 SNP (rs2681472)為GG型或AG型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP (rs699)為MM型或MT型的情況作為第二組；以 SNP (rs2681472)為 AA 型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，SNP (rs2681472)為 AA 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為 MM 型或 MT 型的情況，或者 SNP (rs2681472)為 GG 型或 AG 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為TT型的情況作為第三組；以SNP (rs2681472)為AA型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP(rs699)為TT型的情況作為第四組；所述工序(b)中，能夠按照所述第四組、所述第三組、所述第二組、所述第一組的順序判定風險由高到低。
[0117]進而，以SNP (rsl401982)為 AA 型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為MM型或MT型的情況作為第一組；以SNP (rsl401982)為AG型或GG型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 MM 型或 MT 型的情況，SNP (rs 1401982)為 AA 型、SNP(rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，或者 SNP (rsl401982)為 AA型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP (rs699)為MM型或MT型的情況作為第二組；以SNP(rsl401982)為 AG 型或 GG 型、SNP (rsl799998)為 CC 型或 CT 型、SNP (rs699)為 TT 型的情況，SNP (rs 1401982)為 AG 型或 GG 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為 MM 型或 MT 型的情況、或者以 SNP (rsl401982)為 AA 型、SNP (rsl799998)為 TT 型、SNP (rs699)為TT型的情況作為第三組；以SNP (rsl401982)為AG型或GG型、SNP (rsl799998)為TT型、SNP (rs699)為TT型的情況作為第四組；在所述工序(b)中，也能夠按照所述第四組、所述第三組、所述第二組、所述第一組的順序判定風險由高到低。
[0118]此外，工序(b)中的高血壓發病風險的判定也可以組合通過工序(a)得到的分型結果、和除遺傳標記以外的I個以上高血壓的危險因素來進行。作為除遺傳標記以外的危險因素，例如有人個體的性別、年齡、BMI值、腦血管疾病的有無、心臟病的有無、吸煙的有無、飲酒量、總膽固醇值、HDL膽固醇值、中性脂肪值、空腹時血糖值等。
[0119]利用微陣列法來進行工序(a)中的SNP分型時，優選采用作為本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列，即優選的是，在固相載體上固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP(rslll05364)檢測用多核苷酸和SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸中的至少I種。作為本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列，優選為固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸和SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸中的至少I種以及SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸的微陣列；更優選固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸和SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸中的任一者的微陣列。
[0120]另外，作為本發明的第八方案的高血壓發病風險判定用微陣列，進一步優選在固相載體上固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸、SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸和SNP(rs699)檢測用多核苷酸中的至少I種的微陣列；更優選固定有SNP(rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸和SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸中的至少I種以及SNP (rs699)檢測用多核苷酸的微陣列。進一步優選固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸和SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸中的至少I種、以及SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸和SNP(rs699)檢測用多核苷酸的微陣列；特別優選固定有SNP(rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rsl799998)檢測用 多核苷酸和SNP (rs699)檢測用多核苷酸中的任一者的微陣列。
[0121]另外，本發明中，微陣列是指在固相載體上按照能夠確定位置的方式固定有作為探針的多核苷酸的檢測裝置，固定化有探針(多核苷酸)的載體自身可以為分散性，只要是能夠按照檢測時能確定位置的方式固定在2維的固相載體上的狀態即可。
[0122]另外，通過將用于工序(a)中的SNP分型的高血壓發病風險判定用多核苷酸等制成試劑盒，從而能夠更簡便地進行工序(a)的SNP分型。例如，作為用于選自由SNP(rslll05378)、SNP(rs2681472)、SNP(rsl401982)、SNP(rslll05364XS.SNP(rsl799998)所組成的組中的I種以上SNP的分型的SNP分型試劑盒，優選像作為本發明的第九方案的高血壓發病風險判定用SNP分型試劑盒那樣包含選自由SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸、SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸及在固相載體上固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸和SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸中的至少I種的微陣列所組成的組中的I種以上。此外，作為在選自由SNP (rslll05378)、SNP (rs2681472)、SNP (rsl401982)、及 SNP (rsl799998)所組成的組中的 I 種以上 SNP 和 SNP (rs699)的分型中使用的SNP分型試劑盒，優選像作為本發明的第十方案的SNP分型試劑盒那樣，包含選自由下述多核苷酸和微陣列所組成的組中的I個以上:SNP(rslll05378)檢測用多核苷酸，SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸，SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸，SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸，SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸，SNP (rs699)檢測用多核苷酸，在固相載體上固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸、SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸的微陣列，以及在固相載體上固定有SNP (rslll05378)檢測用多核苷酸、SNP (rs2681472)檢測用多核苷酸、SNP (rsl401982)檢測用多核苷酸、SNP (rslll05364)檢測用多核苷酸、SNP (rsl799998)檢測用多核苷酸以及SNP (rs699)檢測用多核苷酸的微陣列。
[0123]此外，使用特征在于包含用1xP序列夾持ATP2B1基因的堿基序列的全部或一部分而成的堿基序列的ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組載體，能夠制作ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組小動物。特別優選使用包含下述堿基序列的ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組載體，來制作ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組小動物，所述堿基序列中，包含選自由SNP (rs 11105378)、SNP (rs2681472)、SNP(1401982),SNP (rslll05364)所組成的組中的I個以上SNP的ATP2B1基因區域被1xP序列夾持。
[0124]進而，通過使該ATP2B1基因局部缺失小動物制作用1xP重組小動物與以適當的啟動子作為Cre重組酶的表達啟動子的選擇性Cre表達轉基因小動物交配，從而能夠制作ATP2B1基因局部缺失小動物。作為Cre重組酶的表達啟動子，例如優選為選自由Tie-2啟動子、Tie-1啟動子、Flk-1啟動子、SM22啟動子、SM-MHC啟動子、Wtl啟動子、PO啟動子、Pax3啟動子、a MHC啟動子、Nkx2.5啟動子、Tbxl啟動子、四環素誘導啟動子(tetracycline-1nducible promoter)及CMV增強子-雞β -肌動蛋白啟動子(CMVenhancer-chicken β -actin promoter)所組成的組中的一個啟動子。
[0125]這樣制作的ATP2B1基因局部缺失小動物優選呈現出高血壓癥狀。另外，該ATP2B1基因局部缺失小動物能夠優選作為用于篩選`鈣拮抗藥的試驗動物使用，也能夠作為具有ATP2B1基因的基因多態性及表達異常的疾病的模型小動物使用。
實施例
[0126]下面示出實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不限定于以下的實施例。
[0127][實施例1]用于SNP分型的核酸的調制
[0128]以8924個一般地區居民作為對象，為了調查SNP的基因型與高血壓的關系而進行了回顧性隊列研究。這些對象者從橫浜(1811人)、滋賀(3730人)、愛媛(3383人)召集。
[0129]首先，使用作為DNA提取試劑盒的QIAamp DNA Blood KitCQIAGEN GmbH制)，從由對象者采集的末梢血中的白細胞提取各人的基因組DNA。將所得基因組DNA用GenomiPhiDNA Amplification Kit (GE HEALTHCARE JAPAN CORPORATION 制)進行擴增。將擴增獲得的DNA用buffer AE (QIAGEN GmbH制)稀釋至50倍，供于SNP分型。
[0130][實施例2]ATP2B1基因上的SNP(rslll05378)的分型
[0131]以各對象者的完成擴增后的基因組DNA作為模板，通過TaqMan探針法對ATP2B1基因上的SNP(rslll05378)進行分析。具體而言，在實施例1中得到的DNA溶液2.0 μ L中添加 2.5 μ L 的 TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems Inc.制)、0.05口1^對rslll05378的各多態性特異性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID;C—32174448_10>Applied Biosystems Inc.制)、0.45 μ L 的蒸懼水,調制反應溶液后,供于利用PCR法的延伸反應。延伸反應中，在52°C下加熱2分鐘，接著在95°C下加熱10分鐘后，重復60次下述過程:在95°C下加熱15秒鐘、在60°C下加熱I分鐘。延伸反應后，用7900HTFast實時PCR系統(Applied Biosystems Inc.制)測定突光強度，從而對基因多態性進行分型。
[0132][實施例3]rslll05378多態性與高血壓的相關性
[0133]以一般地區居民為對象,通過相關分析(關聯方法(association method))對實施例2中鑒定的SNP的基因型與高血壓的相關性進行分析。
[0134][表 I]
[0135]
【權利要求】
1.用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其中所述遺傳標記為由人個體采集的核酸的SNP遺傳標記rs2681472，所述用途具有以下工序: Ca)對由人個體采集的核酸的SNP遺傳標記rs2681472進行分型的工序， (b)根據通過所述工序(a)得到的分型結果來判定所述人個體的高血壓發病風險的工序，和 所述試劑盒包含: 選自由以下組成的組的用于檢測所述SNP遺傳標記rs2681472的引物或探針: (i )序列號12所示的堿基序列、或作為序列號12所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rs2681472的部分序列的堿基序列； (? )與所述(i )的堿基序列互補的堿基序列； (iii)序列號13所示的堿基序列、或作為序列號13所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rs2681472的部分序列的堿基序列； (iv )與所述(iii)的堿基序列互補的堿基序列。
2.根據權利要求1所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(a)是進一步對由SNP遺傳標記rs 1799998和SNP遺傳標記rs699組成的組中的至少一種SNP遺傳標記進行分型的工序，所述SNP遺傳標記rs 1799998為CYPl 1B2基因的SNP，所述SNP遺傳標記rs699為AGT基因的SNPjP` 所述試劑盒還包含: 用于檢測所述SNP遺傳標記rsl799998的引物或探針，和/或用于檢測所述SNP遺傳標記rs699的引物或探針， 所述用于檢測所述SNP遺傳標記rsl799998的引物或探針選自由以下組成的組: (i )序列號26所示的堿基序列、或作為序列號26所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rsl799998的部分序列的堿基序列； (? )與所述(i )的堿基序列互補的堿基序列； (iii)序列號27所示的堿基序列、或作為序列號27所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rsl799998的部分序列的堿基序列； (iv )與所述(iii)的堿基序列互補的堿基序列；和 所述用于檢測所述SNP遺傳標記rs699的引物或探針選自由以下組成的組: (i )序列號33所示的堿基序列、或作為序列號33所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rs699的部分序列的堿基序列； (? )與所述(i )的堿基序列互補的堿基序列； (iii)序列號34所示的堿基序列、或作為序列號34所示的堿基序列的包含所述SNP遺傳標記rs699的部分序列的堿基序列； (iv )與所述(iii)的堿基序列互補的堿基序列。
3.根據權利要求1所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，按照SNP遺傳標記rs2681472為AA型、AG型、GG型的順序判定風險由高到低。
4.根據權利要求1所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型時，判定為低風險組；為AA型時，判定為高風險組。
5.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs 1799998為CC型或CT型時，判定為低風險組 '為TT型時，判定為高風險組。
6.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs699為麗型或MT型時，判定為低風險組；為TT型時，判定為高風險組；其中M為蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
7.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型，SNP遺傳標記rsl799998為CC型或CT型時，判定為低風險組，SNP遺傳標記rs2681472為AA型，SNP遺傳標記rsl799998為TT型時，判定為高風險組。
8.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型，SNP遺傳標記rs699為MM型或MT型時，判定為低風險組，SNP遺傳標記rs2681472為AA型，SNP遺傳標記rs699為TT型時，判定為高風險組；其中，M為蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
9.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs 1799998為CC型或CT型，SNP遺傳標記rs699為麗型或MT型時，判定為低風險組，SNP遺傳標記rsl799998為TT型，SNP遺傳標記rs699為TT型時，判定為高風險組；其中，M為蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
10.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，`所述工序(b)中，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型，SNP遺傳標記rs 1799998為CC型或CT型，SNP遺傳標記rs699為MM型或MT型時，判定為低風險組，SNP遺傳標記rs2681472為AA型，SNP遺傳標記rsl799998為TT型，SNP遺傳標記rs699為TT型時，判定為高風險組；其中，M為蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
11.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其中所述用途還具有以下工序: 以SNP遺傳標記rs2681472的AA型、SNP遺傳標記rsl799998的TT型、SNP遺傳標記rs699的TT型分別作為高風險多態性， 所述工序(b)中，按照所述高風險多態性的個數為3個、2個、I個、O個的順序判定風險由高到低；其中，T表示蘇氨酸。
12.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其中所述用途還具有以下工序: 以SNP遺傳標記rs2681472的GG型、SNP遺傳標記rsl799998的CC型、SNP遺傳標記rs699的MM型分別作為低風險多態性， 所述工序(b)中，按照所述低風險多態性的個數為O個、I個、2個、3個的順序判定風險由高到低；其中，M表示蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
13.根據權利要求2所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其中所述用途還具有以下工序:以SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型、SNP遺傳標記rsl799998為CC型或CT型、SNP遺傳標記rs699為麗型或MT型的情況作為第一組； 以SNP遺傳標記rs2681472為AA型、SNP遺傳標記rsl799998為CC型或CT型、SNP遺傳標記rs699為MM型或MT型的情況，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型、SNP遺傳標記rs 1799998為CC型或CT型、SNP遺傳標記rs699為TT型的情況，或者，SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型、SNP遺傳標記rsl799998為TT型、SNP遺傳標記rs699為MM型或MT型的情況作為第二組； 以SNP遺傳標記rs2681472為AA型、SNP遺傳標記rsl799998為CC型或CT型、SNP遺傳標記rs699為TT型的情況，SNP遺傳標記rs2681472為AA型、SNP遺傳標記rsl799998為TT型、SNP遺傳標記rs699為MM型或MT型的情況，或SNP遺傳標記rs2681472為GG型或AG型、SNP遺傳標記rsl799998為TT型、SNP遺傳標記rs699為TT型的情況作為第三組； 以SNP遺傳標記rs2681472為AA型、SNP遺傳標記rsl799998為TT型、SNP遺傳標記rs699為TT型的情況作為第四組； 所述工序(b)中，按照所述第四組、所述第三組、所述第二組、所述第一組的順序判定風險由聞到低； 其中，M為蛋氨酸，T表示蘇氨酸。
14.根據權利要求1所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，其通過組合選自由所述人個體的性別、年齡、體重指數BMI值、腦血管疾病的有無、心臟病的有無、吸煙的有無、飲酒量、總膽固醇值、高密度脂蛋白HDL膽固醇值、中性脂肪值、空腹時血糖值所組成的組中的I種以上危險因素，和通過所述工序(a)得到的分型結果來進行。
15.根據權利要求1所述的用于檢測遺傳標記的引物或探針在制備判定高血壓發病風險的試劑盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)通過使用以下來進行: 通過對高血壓的遺傳標記進行薈萃分析而得到的比值比，或者 通過對高血壓的遺傳標記進行隊列研究而得到的相對危險度。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789408SQ201310537931
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2009年2月20日 優先權日:2008年2月21日
【發明者】三木哲郎, 田原康玄, 小原克彥, 名倉潤, 梅村敏, 平和伸仁, 上島弘嗣, 喜多義邦, 中村保幸 申請人:國立大學法人愛媛大學, 國立大學法人滋賀醫科大學, 公立大學法人橫濱市立大學