鑒定不同產地的道地藥材麥冬的方法，以及用于該方法的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及鑒定不同產地的道地藥材麥冬的方法，以及用于該方法的試劑盒。具體地，本發明涉及鑒定浙麥冬和川麥冬的方法，其包括以下步驟：（1）從不同道地產區的麥冬樣品中提取DNA樣品；（2）鑒定如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列第88位堿基。進一步地，本發明涉及如SEQ?ID?NO.1所示序列的SNP88A/G作為分子標記物在用于鑒別浙麥冬和川麥冬中的用途，以及用于該用途中的試劑盒。
【專利說明】鑒定不同產地的道地藥材麥冬的方法，以及用于該方法的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于不同產地的道地藥材種內鑒定【技術領域】，具體涉及用特異的SNP標記對不同產地的道地藥材浙麥冬和川麥冬進行鑒定的方法。
【背景技術】
[0002]藥材麥冬為百合科植物麥冬(Ophiopogon japonicus) (L.f)Ker-Gawl.的干燥塊根，按道地產區不同分為浙麥冬與川麥冬兩個品種。麥冬在我國用藥歷史悠久，被列為“上品”藥材，具有養陰生津、潤肺清心的功效。由于長期的生長環境及栽培方式的不同，麥冬形成了一定的種內變異，產生了兩種不同的“地方性特化基因型”，從而表現出生長周期變化頗大、化學成分的組成與含量也有差異的不同特征。這就需要尋找一種合適的鑒定方法對這兩種不同道地產區的麥冬藥材進行快速準確的種內鑒定。
【發明內容】
[0003]本發明人利用在麥冬葉綠體基因非編碼區psbA-trnH序列上發現SEQ ID N0.1序列，通過primer premier5.0引物設計軟件設計引物LA-F20/R260,通過PCR反應并測序得到這段序列，發現其上具有SNP88A/G。并發現該SNP可用于鑒定浙麥冬和川麥冬。SEQ IDN0.1序列如所示序列所示。
[0004]本發明提供了一種鑒定浙麥冬和川麥冬的方法，其包括以下步驟:
[0005](I)從不同道地產區的麥冬樣品中提取DNA樣品；
[0006](2)鑒定如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列第88位堿基。
[0007]根據本發明的方法，更具體地，當如SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為G，則鑒定為浙麥冬；當如SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為A，則鑒定為川麥冬。
[0008]根據本發明的方法，其進一步包括以所獲的DNA樣品為模板，擴增含有如SEQ IDN0.1所示序列的DNA片段的步驟。
[0009]本領域技術人員可以使用任何本領域公知的方法，檢測上述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列第88位堿基，例如，但并非限定地，如限制性內切酶片段長度多態性(RFLP)、DNA測序法、根據DNA列陣的微測序法、動態等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統方法、單鏈構象多態性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)，等方法。
[0010]本發明的發明人通過大量的引物設計和篩選，最終選出一對特異性好、擴增效率聞的引物，其序列為:
[0011]正向序列LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA (SEQ ID N0.2)；
[0012]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG (SEQ ID N0.3)。
[0013]上述引物用于擴增道地藥材浙麥冬或川麥冬的如SEQ ID N0.1所示的序列。
[0014]根據本發明的方法，更具體地，其包括使用如下引物擴增含有如SEQ ID N0.1所示序列的DNA片段:
[0015]正向序列LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA (SEQ ID N0.2)；
[0016]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG (SEQ ID N0.3)。
[0017]另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，其具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其中在所述核酸的第88位堿基具有SNP88A/G。
[0018]進一步地，本發明提供了如SEQ ID N0.1所示序列的SNP88A/G作為分子標記物在用于鑒別浙麥冬和川麥冬中的用途。
[0019]更具體地，根據本發明的用途，當如SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為G，則鑒定為浙麥冬；當如SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為A，則鑒定為川麥冬。
[0020]另一方面，本發明提供了一種用于鑒別浙麥冬和川麥冬的試劑盒，所述試劑盒含有至少一種用于檢測如SEQ ID N0.1所示序列的SNP88A/G的試劑。
[0021]進一步地，根據本發明的試劑盒，其含有如下序列所示的引物:
[0022]正向序列LA-F20: ATGCTCACAACTTCCCTCTA ；
[0023]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
[0024]本發明 方法適用性廣，能檢測所有能提取出DNA的麥冬道地藥材。因此，能夠對麥冬原植物、藥材、飲片和粉末進行快速、準確的種內鑒定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1所示為浙麥冬和川麥冬LA序列的比對結果。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發明進一步說明。
[0027]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0028]實施例1道地藥材麥冬及其原植物的種內鑒定方法
[0029]I)從不同道地產區收集93份道地藥材及其原植物樣品，分別取IOOmg藥材或40mg葉片，在MM400球磨儀(德國Retsch)上進行研磨粉碎后，先用700 μ L的核分離液清洗3次，再用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。
[0030]表1核分離液配制表
[0031]
【權利要求】
1.一種鑒定浙麥冬和川麥冬的方法，其包括以下步驟: (1)從不同道地產區的麥冬樣品中提取DNA樣品； (2)鑒定如SEQID N0.1所示的核苷酸序列第88位堿基。
2.根據權利要求1所述的方法，其中當SEQID N0.1所示序列的第88位堿基為G，則鑒定為浙麥冬；當SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為A，則鑒定為川麥冬。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其進一步包括以所獲的DNA樣品為模板，擴增含有SEQ ID N0.1所示序列的DNA片段的步驟。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中可以使用選自限制性內切酶片段長度多態性(RFLP),DNA測序法、根據DNA列陣的微測序法、動態等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統方法、單鏈構象多態性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)的方法檢測上述SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列第88位堿基。
5.根據權利要求3所述的方法，其中使用如下引物擴增含有SEQID N0.1所示序列的DNA片段: 正向序列 LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA ； 反向序列 LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
6.一種分離的核酸，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其中在所述核酸的第88位堿基具有SNP88A/G。
7.如SEQID N0.1所示序列的SNP88A/G作為分子標記物在用于鑒別浙麥冬和川麥冬中的用途。
8.根據權利要求7所述的用途，其中當SEQID N0.1所示序列的第88位堿基為G，則鑒定為浙麥冬；當SEQ ID N0.1所示序列的第88位堿基為A，則鑒定為川麥冬。
9.一種用于鑒別浙麥冬和川麥冬的試劑盒，所述試劑盒含有至少一種用于檢測SEQ IDN0.1所示序列的SNP88A/G的試劑。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其含有如下序列所示的引物: 正向序列 LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA ； 反向序列 LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
【文檔編號】C12N15/11GK103540674SQ201310526080
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】陳士林, 劉霞, 林韻涵, 馬曉沖, 張雅琴, 宋明, 王俊 申請人:中國中醫科學院中藥研究所