利用特異基因鑒定高致病型大麗輪枝菌的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium?dahliae)基因，其中，該基因具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。本發明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟：（1）制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；（2）以步驟（1）中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否存在SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列；（3）根據步驟（2）的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型。本發明還提供了一種試劑盒。
【專利說明】利用特異基因鑒定高致病型大麗輪枝菌的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農作物病害防治領域，具體地，涉及一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因、一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種植物致病真菌,它可以導致植物(尤其是農作物如棉花、番茄等)發生黃萎病。但是，不同致病型的大麗輪枝菌菌株的致病表現差別很大，例如某些高致病型的菌株感染棉花后會導致棉花產生嚴重病害而引起棉花產量下降，而某些低致病型的菌株感染棉花后僅導致棉花的輕微病害且對棉花產量影響較小。此外，大麗輪枝菌還表現出一定的潛伏性，即高致病型菌株在感染當年可能不致病，而在次年大范圍地嚴重致病。
[0003]如果能夠檢測出農田中大麗輪枝菌的主要菌株類型，并對其致病型作出準確的判
斷，就可以結合藥物防治和輪作等農業手段抑制病害的發生，從而增加經濟效益和社會效
【發明內容】
[0004]本發明的目的是解決如何準確判斷大麗輪枝菌菌株的致病型的技術問題，提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因、一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法和試劑盒。
[0005]SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列為本發明人發現的在高致病型的大麗輪枝菌菌株的基因組序列中出現而在低致病型的大麗輪枝菌的基因組序列中不出現的序列。因而，對于某一致病型待測的大麗輪枝菌菌株，只要鑒定該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可獲知該大麗輪枝菌菌株是否為高致病型大麗輪枝菌。具體地，如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。并且，如果以該大麗輪枝菌菌株的全基因組DNA待測樣本為模板進行PCR擴增的產物中不存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，就能夠充分證明該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ IDNO:1所示的序列。由此，本發明的發明人得到了本發明的技術方案。
[0006]為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]另一方面，本發明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟:
[0008](I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；
[0009](2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；[0010](3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴增產物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
[0011] 另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有本發明提供的引物和PCR試劑。
[0012]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【具體實施方式】
[0013]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0014]本發明提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因,其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列核酸。
[0015]本發明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟:
[0016]( I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；
[0017](2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0018](3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴增產物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
[0019]其中，SEQ ID NO:4所示的核酸是SEQ ID NO:1所示的核酸的一個片段，它能夠通過上述引物對以SEQ ID NO:1所示的核酸為模板而PCR擴增得到。
[0020]其中，制備待測樣本的步驟可以按照本領域常規的制備用于檢測核酸的樣本的方法進行，本發明沒有特別的要求，例如可以從棉花植株上采集組織，并且將采集的組織在含有抗性的培養基上培養，并且篩選、辨別和分離大麗輪枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版))中所述的方法提取大麗輪枝菌的基因組DNA，即可制備得到待測樣本。
[0021]其中，檢測擴增產物中是否存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的方法可以按照本領域常規的方法和標準進行，例如可以通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如果需要還可以通過對電泳得到的目的條帶進行回收測序來進一步判斷。
[0022]所述擴增中用到的引物可以根據SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的特征及引物設計的規則來設計，優選情況下，所述引物包括如SEQ ID NO:
2(F:5’CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’)所示的正向引物和如 SEQ ID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0023]另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有引物和PCR試劑，其中，所述引物包括如SEQ ID NO:2(F:5’ CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’)所示的正向引物和如SEQID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0024]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，各種大麗輪枝菌的菌株屬于經過合法渠道獲得的遺傳資源。
[0025]實施例1
[0026]本實施例用于說明待測樣本的制備。具體地，是從80個不同的大麗輪枝菌菌株(編號為VDGl至VDG80)的基因組DNA的制備。
[0027]切取棉花植株離地表約10_35cm處的莖，切成Imm3左右大小的小塊，接種在在含有抗生素(氨芐青霉素、利福平和鏈霉素，濃度均為lOOyg/ml)的PDA培養基(含有馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L)上，25°C下培養7天，根據大麗輪枝菌的標準菌落形態鑒別大麗輪枝菌的菌落。得到鑒別的大麗輪枝菌的菌落即作為大麗輪枝菌菌株樣品。 [0028]按照上述方法，從80個不同的棉花植株中取得80個不同的大麗輪枝菌菌株，將上述80個不同的大麗輪枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版)中所述的方法，分別提取基因組DNA樣本，得到待測樣本1-80。
[0029]實施例2
[0030]本實施例用于說明上述80個不同的大麗輪枝菌菌株的致病型的檢測結果。
[0031]參照文獻(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進展及其抗性鑒定方法，江西農業學報，2008，20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，對實施例1中所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株進行棉花苗期致病型鑒定。以所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株在接種健康棉花植株后的病情指數來表征致病型的高低。
[0032]具體地，將大麗輪枝菌在查比克培養基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的瓊脂)上培養至產生孢子，用無菌水洗下孢子得到孢子懸液，并將孢子懸液中的孢子濃度調整至2 X IO6個/ml。然后，在同一品種的棉花15日齡幼苗的下胚軸處，使用Iml規格的無菌注射器接種上述孢子懸液，每株接種量為ΙΟΟμ 1，接種后每周統計發病情況，計算第四周的病情指數。
[0033]本實施例檢測得到了上述80個不同的大麗輪枝菌菌株的致病型，通過上述鑒別標準，鑒定出其中61個大麗輪枝菌菌株的病情指數均高于35，屬于高致病型，而另外19個大麗輪枝菌菌株的病情指數均低于20，不屬于高致病型。
[0034]上述61個屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDGl。上述19個不屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51。
[0035]實施例3
[0036]按照Illumina公司的測序儀Genome Analyzer的說明書(Solexa技術)中規定的方法，測定大麗輪枝菌菌株(編號為VDGl以及VDG2)的全基因組序列。
[0037]本實施例得到了上述2個不同的大麗輪枝菌菌株的全基因組序列，通過序列比對，鑒定出VDGl的全基因組序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列；而VDG2的全基因組序列中含有SEQ ID NO:1所示的序列。[0038]通過上述相同的方法，鑒定出上述80個不同的大麗輪枝菌菌株中的61個(分別為 VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl 1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDG1)的基因組的序列中均含有SEQ ID NO:1所示的序列；并且，另外的19個大麗輪枝菌菌株(分別為VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80和VDG51)的全基因組序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0039] 根據實施例2和實施例3的結果可以確定，如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
[0040]實施例4
[0041]以實施例1中分別制得的檢測樣本DNA作為模板進行PCR擴增，引物包括如SEQ ID NO:2 (F:5’ CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’ )所示的正向引物和如 SEQ ID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0042]具體的擴增條件包括:94°C，10分鐘；(94°C，30秒，54°C，45秒，72°C，I分鐘)35個循環；72°C，10分鐘，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0043]檢測結果說明:上述80個不同的大麗輪枝菌菌株中的61個(分別為VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl 1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDGl)的基因組的序列中均存在SEQ ID NO:4所示的序列；證明這些大麗輪枝菌菌株均存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，據此判斷這些大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。并且，另外的19個大麗輪枝菌菌株(分別為 VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51)的基因組的序列中不存在所述SEQ ID NO:4所示的序列；證明這些大麗輪枝菌菌株均不存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，據此判斷這些大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
[0044]根據實施例2和實施例4的結果可以確定，如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，則該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，則該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。
【權利要求】
1.一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因,其特征在于,該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
2.一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟: (O制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本； (2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列； (3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴增產物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述步驟(2)PCR擴增所用的引物包括如SEQIDNO:2所示的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
4.一種試劑盒，所·述試劑盒含有根據權利要求3中的引物和PCR試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525831SQ201310524788
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】戴小楓, 陳捷胤, 馬雪峰, 徐 明, 李蕾, 孔志強, 包郁明, 肖紅利, 桂月晶 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所