一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及將從普羅威登斯菌（Providenciasp.）JNB815中提取的具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯(lián)，得固定化雙功能酶。該固化酶以尿素為底物時(shí)，最適溫度為40℃，最適pH為4.0；以EC為底物時(shí)，最適溫度60℃，最適pH為4.5。兩種酶活的貯存半衰期分別為54d及45d。本發(fā)明還涉及這種固定化雙功能酶的應(yīng)用：尿素去除率可達(dá)93.03%，EC去除率為56.60%。本發(fā)明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，且固定化雙功能酶可以重復(fù)利用，在去除黃酒中微量尿素和EC的應(yīng)用中具有更多的優(yōu)勢。
【專利說明】一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用，具體地說是將普羅威登斯菌iProvidencia sp.) JNB815中提取的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋，京尼平交聯(lián)，固化得固定化雙功能酶，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基甲酸乙酯(EC)，是2A類致癌性的物質(zhì)，微量存在于大部分發(fā)酵食品和酒精飲料中。研究發(fā)現(xiàn)黃酒中90%氨基甲酸乙酯主要由尿素和乙醇經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成的。通過向酒中添加少量的脲酶可以有效去除尿素、抑制氨基甲酸乙酯形成，而EC降解酶則能直接有效的分解成品黃酒中已經(jīng)產(chǎn)生的EC。
[0003]本實(shí)驗(yàn)室所篩選的普羅威登斯菌sp.)JNB815能產(chǎn)生兼有降解尿素和EC活性的雙功能酶，將這種菌產(chǎn)生的粗酶經(jīng)過初步提純后進(jìn)行固定化，可應(yīng)用在黃酒中同時(shí)去除尿素和EC，且可以分離回收再利用。此外本發(fā)明采用的固定化材料為天然大分子殼聚糖、明膠和京尼平，這三者均無毒性，親水性好，具有適合酶催化反應(yīng)的天然微環(huán)境。[0004]我國出口黃酒中所用的脲酶均從國外進(jìn)口，國內(nèi)尚未形成生產(chǎn)規(guī)模，而國內(nèi)及國際上關(guān)于EC降解酶的報(bào)道也較少。因此酒用脲酶和EC降解酶的研究對我國釀酒業(yè)的品質(zhì)提升及國際市場拓展等方面均有深遠(yuǎn)的意義。而具有同時(shí)降解尿素和EC酶活的雙功能酶則在黃酒的應(yīng)用中具有更多的優(yōu)勢。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種天然材料體系復(fù)合固定化酒用雙功能酶的制備方法及應(yīng)用，將從sp.JNB815菌體細(xì)胞破碎液中提取的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯(lián)，得固定化雙功能酶，并應(yīng)用于黃酒中去除尿素和EC。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，將從普羅威登斯菌iProvidencia sp.) JNB815菌體細(xì)胞破碎液中提取的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯(lián)，得固定化酒用雙功能酶。工藝為:
A、游離酶提取:
(1)菌種:采用普羅威登斯菌O0Toriofeflciasp.)JNB815,本實(shí)驗(yàn)室篩選，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326 ；
(2)游離酶的提取:
種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH調(diào)pH 7.0，用純水配制；接種量3%，37°C搖床培養(yǎng)8_12h,轉(zhuǎn)速 150 rpm ；
發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，HCl調(diào)ρΗ5.5，用純水配制；接種量5%，37°C搖床培養(yǎng)20-24 h，轉(zhuǎn)速150 rpm ；
收集菌體:將發(fā)酵液4°C、8000 r/min離心5 min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，PH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，每升發(fā)酵液離心后所得菌體復(fù)溶于PH4.5的100 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中；
超聲波破碎:超聲波功率300 W，破碎時(shí)間15 min (破碎時(shí)間3 S、間隔時(shí)間3 S)，處理量35 mL ;將破碎液于4°C下10000 r/min離心20 min,收集上清液，即為游離酶酶液；
B、固定化過程:
(3)稱取殼聚糖:3-5g、明膠廣3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌均勻后，超聲脫泡；取質(zhì)量濃度20%的NaOH溶液和無水乙醇按4:1的體積比混合均勻制成200-300 mL凝結(jié)液；用注射器將殼聚糖和明膠混合溶液滴入凝結(jié)液中，形成直徑3-4 _的微球，凝結(jié)一段時(shí)間后用去離子水洗滌殼聚糖微球至中性，濾干；
(4)將步驟(3)所得殼聚糖微球在30°C恒溫水浴震蕩的條件下，與質(zhì)量濃度0.4%的京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)，殼聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL計(jì)為1: 5，交聯(lián)時(shí)間為6h，洗滌除去游離的京尼平溶液；活化后的微球與步驟A中的游離酶酶液在4°C冰箱中靜置8h進(jìn)行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后，吸出未固定的游離酶酶液，并洗滌微球至表面無游離酶為止，所得固定化酶貯存在4 V冰箱中，備用。
[0007]2、該固定化酒用雙功能酶的性質(zhì):
最適溫度、最適pH及忙存半衰期的確定:
(I)在20-70°C范圍內(nèi)，每隔10°C，分別測定酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。固定化酒用雙功能酶催化尿素及EC的最適溫度分別為40°C及60°C。
[0008](2)在ρΗ3.0-8.0范圍內(nèi)，每隔0.5個(gè)pH梯度，分別測定酶活，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。固定化酒用雙功能酶催化尿素及EC的最適pH分別為4.0及4.5。
[0009](3)將固定化酒用雙功能酶放于檸檬酸緩沖液中，4°C冰箱內(nèi)保存，每隔三天測定固定化酶以尿素和EC為底物的酶活，兩種酶活的半衰期分別為54 d及45 d。
[0010]3、固定化酒用雙功能酶的應(yīng)用:在內(nèi)徑3 cm,長12 cm的層析柱中,黃酒的固定化酶加量為37.5 U/mL,調(diào)節(jié)流速I mL/min,使400 mL的酒樣流過反應(yīng)器,循環(huán)處理4次,尿素去除率能達(dá)到96.92%。在32°C，搖床轉(zhuǎn)速100 rpm的條件下，黃酒樣品中固定化尿素降解酶加酶量為0.04 U/mL黃酒時(shí)，固定化酶處理黃酒20 h后，尿素去除率可達(dá)93.03%。同樣搖床條件下，樣品中固定化EC降解酶的加酶量為0.17 U/mL時(shí)，反應(yīng)20 h后，EC去除率為 56.60%ο
[0011]游離酶活測定方法:采用靛酹藍(lán)反應(yīng)(Berthelot reaction)比色法
酶活力定義:在常壓，37°C，pH4.5條件下，每分鐘分解底物尿素或氨基甲酸乙酯產(chǎn)生IMfflol氨為一個(gè)酶活力單位。其中，尿素降解酶和EC降解酶活力的測定分別采用尿素和EC為底物。
[0012]固定化酒用雙功能酶酶活測定方法:取0.5 g固定化酒用雙功能酶分別浸入一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的PH4.5的3%的尿素或EC溶液中，在37°C恒溫水浴箱中保溫20 min后，過濾取其濾液，余下的方法與游離酶活力測定相同。固定化雙功能酶活力定義同游離酶。
[0013]尿素含量的測定方法:二乙酰一肟法。[0014]EC含量的測定方法:采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。
[0015]本發(fā)明的有益效果:游離酶的提取方法可以用工業(yè)生產(chǎn)方法代替，固定化酒用雙功能酶的制作過程可以用機(jī)器制作代替，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。該固定化酒用雙功能酶能在酒中穩(wěn)定發(fā)揮作用，尿素去除率高，在黃酒中加入固定化酒用雙功能酶后尿素去除率能達(dá)到93.03%，EC去除率能達(dá)到56.60%。且固定化酒用雙功能酶便于回收，可重復(fù)利用多次。本發(fā)明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，在勾兌，澄清酒的過程中，添加固定化酒用雙功能酶，就可以降低尿素和EC含量，是目前較為理想的同時(shí)去除酒中尿素和EC的方法。
[0016]生物材料樣品保藏:一株普羅威登斯菌G0Toriofeflcia sp.)JNB815,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號:CGMCC N0.8326，保藏日期2013年10月12日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1固定化酒用雙功能酶制備工藝示意圖。
【具體實(shí)施方式】[0018]實(shí)施例1:稱取稱取殼聚糖:1-5 g、明膠廣3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌均勻后，超聲脫泡。取20%的NaOH溶液和無水乙醇按4:1的體積比混合均勻制成200-300 mL凝結(jié)液。用注射器將殼聚糖和明膠混合溶液滴入凝結(jié)液中，形成直徑3-4 _的微球，凝結(jié)一段時(shí)間后用去離子水洗滌殼聚糖微球至中性。在30°C恒溫水浴震蕩的條件下，將殼聚糖微球與質(zhì)量濃度0.4%的京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)，殼聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL計(jì)為1: 5,交聯(lián)時(shí)間為6h,洗漆除去游離的京尼平溶液；活化后的微球與游離酶液在4°C冰箱中靜置8h進(jìn)行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后吸出未固定的游離酶，并洗滌微球至表面無游離酶為止，所得固定化酶貯存在4°C冰箱中，備用。
[0019]實(shí)施例2:將實(shí)施例1所得的固定化酒用雙功能酶15 g (即加酶量為37.5U/mL)裝入內(nèi)徑3 cm,長12 cm的柱子中，調(diào)節(jié)酒樣流速I mL/min,使400 mL的酒樣(尿素含量為74.94 mg/L)流過反應(yīng)器，所有酒樣流過柱子后，測定總尿素去除率。循環(huán)處理4次，測定每次過柱后的尿素去除率。固定化酒用雙功能酶首次可去除酒樣中50.77%的尿素，同一黃酒樣品經(jīng)重復(fù)過柱4次后,尿素去除率達(dá)96.92%,尿素終濃度降低為2.31 mg/L。
[0020]實(shí)施例3:分別配制15 mL尿素加量均為25 mg/L的黃酒及模擬酒(50%乙醇)樣品，樣品中固定化酒用雙功能酶加量分別為0.03 U/mL和0.04U/mL，32°C搖床100 rpm反應(yīng)20 h，測定尿素去除率。在兩種不同加酶量條件下，固定化酒用雙功能酶對黃酒的尿素去除率分別為74.16%和93.03%，對模擬酒的尿素去除率分別為95.16%和98.01%。
[0021]實(shí)施例4:將實(shí)施例1所得的固定化酒用雙功能酶按0.10U/mL和0.17U/mL的比例分別加到15 mL黃酒樣品中(EC含量277.83 Pg/L)，32°C搖床100 rpm反應(yīng)20 h，采用GC-MS外標(biāo)法測定黃酒樣品的EC含量。固定化雙功能酶的EC去除率分別為46.06%及56.60%。
【權(quán)利要求】
1.一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，其特征在于將從普羅威登斯菌iProvidencia sp.)JNB815菌體細(xì)胞破碎液中提取的游離雙功能酶，經(jīng)殼聚糖吸附、明膠包埋和京尼平交聯(lián)，得固定化酒用雙功能酶；工藝為: A.游離酶提取: (1)菌種:采用普羅威登斯菌O0Toriofeflciasp.)JNB815,本實(shí)驗(yàn)室篩選，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326 ； (2)游離酶的提取:菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)獲得一定量菌體，將發(fā)酵液4°C、.8000rpm離心5 min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，離心獲得全細(xì)胞；將獲得的全細(xì)胞用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發(fā)酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300 W、.15min,破碎時(shí)間3 S、間隔時(shí)間3 s,處理量35 mL ;破碎液在4°C、10000 rpm離心20 min,收集上清液，即為游離酶酶液； B.固定化過程: (3)稱取殼聚糖:3~5g、明膠廣3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力攪拌器上攪拌均勻后，超聲脫泡；取質(zhì)量濃度20%的NaOH溶液和無水乙醇按4:1的體積比混合均勻制成.200-300 mL凝結(jié)液；用注射器將殼聚糖和明膠混合溶液滴入凝結(jié)液中，形成直徑3-4 _的微球，凝結(jié)一段時(shí)間后用去離子水洗滌殼聚糖微球至中性，濾干； (4)將步驟(3)所得殼聚糖微球在30°C恒溫水浴震蕩的條件下，與質(zhì)量濃度0.4%的京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)，殼聚糖微球:京尼平溶液的比g/mL計(jì)為1: 5，交聯(lián)時(shí)間為6h，洗滌除去游離的京尼平溶液；活化后的微球與步驟A中的游離酶酶液在4°C冰箱中靜置8h進(jìn)行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后，吸出未固定的游離酶酶液，并洗滌微球至表面無游離酶為止，所得固定化酶貯存在4°C冰箱中，備用。
2.用權(quán)利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶，其特征在于該固定化酒用雙功能酶催化尿素反應(yīng)的最適溫度為40°C，最適pH為4.0，酶活半衰期為54 d ;催化EC反應(yīng)的最適溫度60°C，最適pH為4.5，酶活半衰期為45 d。
3.用權(quán)利要求1方法制備的固定化酒用雙功能酶的應(yīng)用:其特征在于在內(nèi)徑3cm，長.12 cm的層析柱中，黃酒的固定化酶加量為37.5 U/mL，調(diào)節(jié)流速I mL/min，使400 mL的酒樣流過反應(yīng)器，循環(huán)處理4次，尿素去除率能達(dá)到96.92% ;在32°C、搖床轉(zhuǎn)速100 rpm的條件下，黃酒樣品中固定化尿素降解酶加酶量為0.04 U/mL黃酒時(shí)，固定化酒用雙功能酶處理黃酒20 h后，尿素去除率可達(dá)93.03% ;同樣搖床條件下，樣品中固定化EC降解酶的加酶量為0.17 U/mL時(shí)，反應(yīng)20 h后，EC去除率為56.60%。
【文檔編號】C12N11/04GK103525803SQ201310513221
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】田亞平, 查小紅, 楊廣明 申請人:江南大學(xué)