兩株低溫泡菜乳酸菌的增殖培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種低溫泡菜乳酸菌10℃條件下的增殖培養基，屬于生物【技術領域】。適宜植物乳桿菌的增殖培養基：蛋白胨0.5%～1.5%，牛肉膏0.1%～1.0%，乳糖0.5%～1.5%，葡萄糖1.0%～2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，白菜汁補足1000mL，調pH至7.2，121℃滅菌15min；適宜腸膜明串珠菌的增殖培養基：蛋白胨1.0%～2.0%，牛肉膏0.5%～1.5%，乳糖0.1%～1.0%，葡萄糖1.0%～2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，白菜汁補足1000mL，調pH至7.2，121℃滅菌15min；采用該培養基，活菌數分別可達6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，較白菜汁基礎培養基提高了6.1倍和10.4倍，而與采用MRS培養基相比，活菌數相近，且節約成本。
【專利說明】兩株低溫泡菜乳酸菌的增殖培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種低溫泡菜乳酸菌增殖的改良白菜汁培養基，屬于生物【技術領域】。【背景技術】
[0002]乳酸菌作為一類化能異養菌，蛋白質分解和氨基酸合成能力較弱，只能通過糖類發酵獲取能量，對培養基的營養要求比較苛刻，所以需向其生長的環境提供適量的營養物質，如碳源、氮源等。
[0003]實驗室培養乳酸菌常用的MRS培養基不僅成分復雜、成本高、制作繁瑣，而且接種乳酸菌培養后的發酵液黏度以及蛋白沉淀又不利于菌體的分離收集，而泡菜乳酸菌的培養可采用廉價易得的白菜汁、胡蘿卜汁等。由于不同乳酸菌生長條件存在一定差異，因此篩選出不同種類乳酸菌的最適增殖培養基具有重要意義。
[0004]目前為止較多研究的是常溫下分離的乳酸菌，所以泡菜工業化生產使用的菌劑也多為中溫型乳酸菌制備的，然而四川泡菜生產上蔬菜的收獲和鹽潰發酵也多集中在冬季，氣溫偏低，常溫乳酸菌對泡菜的發酵速度過慢或停止，因而酸度低，雜菌抑制能力弱，為保證腌潰蔬菜不變質，必須增加食鹽用量，導致在成品泡菜生產中增加脫鹽工藝和廢水處理成本，甚至還需要添加有機酸以符合泡菜酸度的要求，不但影響了泡菜品質還制約著泡菜的工業化生產,耐低溫乳酸菌的應用可以 解決這一生產問題。
[0005]迄今為止，對于低溫乳酸菌的研究報道較少，楊曉輝等研究了 30°C條件下，分離自泡菜的4株低溫發酵乳酸菌Lat.ULat.2、Leu.1和leu.2在不同蔬菜汁培養基中的增殖情況；田菊梅等研究了 2株低溫乳酸菌CGMCC4775和CGMCC4776在20-30°C條件下，混菌培養的增殖情況；然而對于低溫(10°C)條件下，低溫泡菜酸菌加富培養的研究尚未見報道。
[0006]本專利是以兩株源于四川泡菜的優良耐低溫泡菜乳酸菌3m_l {Lactobacillusplan tarum) (GenBank 注冊號:KC292491)矛口 8m_9(Z<9Wco/?o5^oc mesen teroides ) (GenBank注冊號:KC292492)為對象，10°C條件下，通過在白菜汁培養基中添加碳源、氮源及緩沖劑優化了其最適的增殖培養基配方，與MRS培養基相比，節約了成本，以白菜汁為基礎培養基更接近泡菜乳酸菌發酵的蔬菜環境，為低溫乳酸菌發酵菌劑的制備和低溫發酵泡菜的應用奠定了基礎。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種既能節約成本、提高低溫泡菜乳酸菌活菌數，又利于菌體收集且還為泡菜低溫發酵提供馴化環境的培養基。
[0008]本發明提供了一種低溫泡菜乳酸菌10°C條件下的增殖培養基，適宜于植物乳桿菌的增殖培養基為:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~1.5%，葡萄糖
1.0%~2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，白菜汁(選取清洗、浙干的新鮮白菜打漿過100目紗布得到菜汁)補足1000mL,調pH至7.2，121 °C滅菌15min ;適宜于腸膜明串珠菌的增殖培養基為:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%，乳糖0.1%~1.0%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氫二鉀 0.2%,白菜汁補足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C滅菌 15min。
[0009]本發明的具體發明過程如下。
[0010]I)將兩次活化的低溫乳酸菌接種于白菜汁基礎培養基中，10°C培養192h，每12h取樣，測定發酵液活菌數、0D600/10和pH，繪制生長曲線，確定菌株的最佳收獲期為72h。
[0011]2)選擇合適的碳源、氮源、緩沖劑及濃度，配制成各種不同的增殖培養基，10°C培養72h，并測定培養前后發酵液的活菌數和pH，同時與白菜汁基礎培養基和MRS培養基進行比較，確定最佳增殖因子為蛋白胨、牛肉膏、乳糖、葡萄糖和磷酸氫二鉀。
[0012]3)選擇步驟2)確定的最佳增殖因子，通過正交試驗設計配制培養基，10°C培養72h,并測定培養前后發酵液的活菌數和pH，確定低溫乳酸菌的最優培養基配方，其中適宜于植物乳桿菌的增殖培養基為:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~
1.5%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，白菜汁(選取清洗、浙干的新鮮白菜打漿過100目紗布得到菜汁)補足1000mL,調pH至7.2，121°C滅菌15min ;適宜于腸膜明串珠菌的增殖培養基為:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%，乳糖0.1%~1.0%，葡萄糖1.0%~
2.0%，磷酸氫二鉀 0.2%,白菜汁補足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C滅菌 15min。
[0013]4)上述步驟中活菌數測定采用平板菌落計數法；0D600/10采用無菌生理鹽水將培養液稀釋10倍，在600nm下測定其吸光度值；pH采用精密pH計直接測定。
[0014]本發明所用的培養基為:MRS培養基:蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母粉0.5%，葡萄糖2.0%，吐溫80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，醋酸鈉0.5%，硫酸鎂0.058%,硫酸錳0.025%,蒸餾水補足1000mL,調pH至6.2-6.4，121°C滅菌15min ;白菜汁基礎培養基:選取清洗、浙干的新鮮白菜打漿過100目紗布得·到菜汁至1000mL (不加蒸餾水)，調pH至7.2，121°C，滅菌15min。此兩種固體培養基在液體培養基中再加20g/L瓊脂。
[0015]本發明低溫泡菜乳酸菌的增殖培養基選用了廉價易得的白菜為原料，成分簡單、操作方便，該培養基不僅能提高低溫乳酸菌的活菌數，而且與采用MRS培養基培養相比，其活菌數相近，且離心收集得率明顯要高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為10°C條件下植物乳桿菌在白菜汁基礎培養基中的生長曲線。
[0017]圖2為10°C條件下腸膜明串珠菌在白菜汁基礎培養基中的生長曲線。
[0018]圖3為在白菜汁基礎培養基中添加不同營養因子對低溫乳酸菌生長的影響。
[0019]圖4為正交試驗培養基成分表。
[0020]圖5為植物乳桿菌的培養基優化的四因素三水平正交試驗表。
[0021]圖6為腸膜明串珠菌的培養基優化的四因素三水平正交試驗表。
【具體實施方式】
[0022]實例1:一種適宜于植物乳桿菌3m_l的改良白菜汁培養基:蛋白胨0.5%~1.5%,牛肉膏0.1%~1.0%,乳糖0.5%~1.5%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氫二鉀0.2%,白菜汁補足 1000mL, il pH7.2，121°C滅菌 15min。
[0023]將兩次活化的植物乳桿菌3m_l分別接種于白菜汁基礎培養基、MRS培養基以及優化的改良白菜汁培養基中，10°C培養72h，測定發酵液培養前后的活菌數，并將其在6000rpm條件下離心IOmin,測定沉降細胞活菌數。
[0024]由結果可知植物乳桿菌3m_l在上述培養基中初始活菌數分別為1.21 X IO7Cfu/mL、l.22X 107cfu/mL 和 1.19 X 107cfu/mL,經過 72h 培養，活菌數分別為 9.90 X 108cfu/mL、6.07X 109cfu/mL和6.05X 109cfu/mL,與采用白菜汁基礎培養基培養相比，提高了 6.1倍，與采用MRS培養基培養的活菌數相近無差異，然而離心后其收集細胞得率達到96.20%,明顯高于采用MRS培養基培養的收集細胞得率(80.44%)，且配制1000mL上述改良白菜汁培養基需花費9元，而自行配制1000mL MRS培養基需花費13元，商品化的合成MRS培養基每1000 mL需要40元。
[0025]實例2:—種適宜于腸膜明串珠菌8m_9增殖的培養基:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%%,乳糖0.1%~1.0%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氫二鉀0.2%,白菜汁補足1000mL,調 pH 至 7.2，121°C滅菌 15min。
[0026]將兩次活化的腸膜明串珠菌8m_9分別接種于白菜汁基礎培養基、MRS培養基以及優化的白菜汁培養基中，10°C培養72h，測定發酵液培養前后的活菌數，并將其在6000rpm條件下離心lOmin，測定沉降細胞活菌數。
[0027]由結果可知腸膜明串珠菌8m_9在上述培養基中初始活菌數分別為1.21 X IO7Cfu/mL、l.23X 107cfu/mL 和 1.19 X 107cfu/mL,經過 72h 培養，活菌數分別為 7.05 X 108cfu/mL、
6.47 X 109cfu/mL和7.47 X 109cfu/mL，與采用白菜汁基礎培養基培養相比，提高了 10.4倍，與采用MRS培養基培養的活菌數相近無差異，然而離心后其收集細胞得率達到97.32%，明顯高于采用MRS培養基培養的收集細胞得率(85.42%)，且配制1000mL上述改良白菜汁培養基需花費10元，而自行配 制1000mL MRS培養基需花費13元，商品化的合成MRS培養基每1000 mL需要40元。
[0028]以上的實例僅僅是對本發明的實施方式進行描述，而并非對本發明的范圍進行限定，對于本領域的技術人員來說，可以對上述說明進行改進或變形，但所有的這些改進或變形均應落入本發明的權利要求確定的保護范圍。
【權利要求】
1.一種低溫泡菜乳酸菌的增殖培養基，適宜于植物乳桿菌(耐低溫菌)的增殖培養基為:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~1.5%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，白菜汁(選取清洗、浙干的新鮮白菜打漿過100目紗布得到菜汁)補足1000mL,調pH至7.2，121°C滅菌15min;適宜于腸膜明串珠菌(耐低溫菌)的增殖培養基為:蛋白胨1.0%~2.0%,牛肉膏0.5%~1.5%,乳糖0.1%~1.0%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氫二鉀0.2%,白菜汁補足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C滅菌 15min。
2.根據權利要 求1所述的培養基，其特征在于培養溫度為10°C。
【文檔編號】C12R1/25GK103589664SQ201310495192
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】不公告發明人 申請人:四川農業大學